Účinok synergie živín na ľudské bunky osteosarkómu U-2 OS; DR
M. Waheed Roomi, Vadim Ivanov, Matthias Rath a Aleksandra NiedzwieckiOdpovedajúci autor: Alexandra Niedzwiecki, Ph.D.
1260 Memorex Drive
Santa Clara, CA, 94050 USA
Telefón: 408-567-5564
Fax: 408-986-9403
E-mail: [email protected]
krátka verzia
Úvod:
Súčasná liečba primárnych malígnych nádorov kostí alebo mäkkých tkanív, ktoré vznikajú z mezenchymálnych buniek tvoriacich kosti, má zlú prognózu, najmä z dôvodu zvýšeného rizika, že pri chemoterapii vzniknú ďalšie karcinómy. Preto sú potrebné nové liečebné stratégie, ktoré sú účinné bez toxických vedľajších účinkov. Štúdia in vitro, ktorá sa nedávno uskutočnila v našom laboratóriu, preukázala, že Nutrient Synergy (NS), jedinečná formulácia zložená z lyzínu, prolínu, arginínu, kyseliny askorbovej a epigalokatechíngalátu, má chemopreventívny účinok na rôzne typy rakoviny. NS demonštroval potenciálnu synergickú protirakovinovú aktivitu inhibíciou matrixových metaloproteináz, kľúčových enzýmov proti invázii a metastázam.
Cieľ:
Skúmali sme vplyv synergie živín na ľudské bunky osteosarkómu U-2 Os meraním cytotoxicity, úpravy matrixových metaloproteináz (MMP): MMP-2 a MMP-9 a invazívneho potenciálu.
Metódy a látky:
Ľudské bunky osteosarkómu U-2 Os sa kultivovali v médiu McCloy, ktoré bolo ošetrené 10% fetálnym hovädzím sérom, a s antibiotickými 24-jamkovými kultivačnými doštičkami. Pri sútoku boli bunky nastavené na 0, 10, 50, 100, 500 a 1 000 mg/ml výživovej synergie, každá dávka bola trojitá. Cytotoxicita sa hodnotila podľa počtu buniek nameraných MTT testom po 24 hodinách, expresie MMP gelatinázovou zymografiou v kontrolnom médiu a invázie Matrigelom.
Výsledky:
Synergia živín bola netoxická pri 10 mg/ml a súčasná dávková odpoveď toxicity bola maximálne o 60% vyššia ako kontrolná úroveň 1 000 mg/ml. Zymografia ukázala na dávke závislú inhibíciu produkcie MMP-2 a MMP-9 prostredníctvom synergie živín s prakticky úplnou inhibíciou pri koncentrácii 500 mg/ml. Invázia buniek osteosarkómu Matrigelom bola značne znížená pri 50 mg/ml (74%) a úplne inhibovaná pri koncentrácii 100 mg/ml.
Záver:
Naše výsledky naznačujú, že synergia živín je vynikajúcim kandidátom na terapeutické použitie pri liečbe osteosarkómu z dôvodu inhibície expresie MMP, anglogenézy a invázie - všetkých dôležitých a sľubných parametrov pre skríning rakoviny.
úvod
Osteosarkóm, primárny malígny nádor kostí alebo mäkkých tkanív, ktorý vzniká z mezenchymálnych buniek, ktoré tvoria kosti, sa všeobecne vyvíja v distálnom femure (stehenná kosť), proximálnej (smerom ku kmeňu) holennej kosti (holennej kosti), proximálnom humeru (humerus) a distálny polomer (hovoril). Klasický osteosarkóm vykazuje agresívny rýchly rast s vysokým rizikom lokálnych sekundárnych metastáz a skorých pľúcnych metastáz. Je to najbežnejšia rakovina kostí a šiesta najbežnejšia rakovina v detstve, ktorá sa zvyčajne vyvíja u dospievajúcich, ktorí zažívajú prudký rast. Je častejšia u chlapcov ako u dievčat. Väčšina osteosarkómov vzniká z nededičných chýb v DNA rastúcich kostných buniek. Pretože sa tieto chyby vyskytujú náhodne a nepredvídateľne počas rastu kostí, nie je v súčasnosti možné účinne zabrániť tomuto typu rakoviny (1).
Súčasné terapie osteosarkómu pozostávajú z chirurgického zákroku (amputácia alebo chirurgický zákrok na záchranu končatiny) a chemoterapie. Tieto terapie sú spojené so zlou prognózou, najmä kvôli vysoko invazívnej povahe tohto karcinómu a zvýšenému riziku metastáz a vzniku ďalších druhov rakoviny vyvolaných chemoterapiou. Z 31 pacientov v klinickom skúšaní s diagnostikovaným lokalizovaným osteosarkómom (2) a ktorí boli liečení konvenčnou chemoterapiou (vysoká dávka metotrexátu a leukovarínu u 3 pacientov a intraarteriálna cisplatina u 28 pacientov) v Andersonovom onkologickom centre, iba u 3 pacientov nedošlo k lokálnemu relapsu alebo Metastázy v pľúcach počas nasledujúceho obdobia viac ako 225 mesiacov. Medzi vedľajšie účinky chemoterapie patrí tiež anémia, abnormálne krvácanie, zvýšené riziko infekcie v dôsledku deštrukcie kostnej drene, poškodenia pečene a obličiek, menštruačné nepravidelnosti, cystitída a krv v moči, osteosarkóm kože a osteosarkóm, ktorý metastazuje do pľúc, mozgu alebo iných kostí (1).
Jedným z kľúčových mechanizmov, pomocou ktorého sa rakovinové bunky šíria a metastázujú v tele, je tiež enzymatická deštrukcia spojivového tkaniva. Terapeutické pokusy o obmedzenie tohto procesu konkrétnymi liekmi neboli úspešné a v súčasnosti nie sú k dispozícii žiadne ďalšie prostriedky na obmedzenie rakovinových metastáz. Po celé desaťročia štandardná liečba osteosarkómu spočívala v chirurgickom zákroku a chemoterapii, ktoré sú zamerané na ničenie rakovinových buniek, ale nie na metastázy. Radiačné žiarenie a chemoterapia sú nielen neúčinné pri dosiahnutí liečby, ale bez rozdielu napádajú všetky bunky, spôsobujú poškodenie buniek, ničia spojivové tkanivo a umožňujú metastázy rakoviny. Je zrejmé, že je potrebný bezpečný a efektívny prírodný postup, ktorý môže obmedziť proces metastázovania rakoviny.
Všetky typy rakovinových buniek tvoria nádory oslabením extracelulárnej matrix (ECM) pomocou rôznych matrixových metaloproteináz (MMP). Aktivita týchto enzýmov ide ruka v ruke s agresivitou rastu nádoru a dotieravosťou rakoviny. V roku 1992 Rath a Pauling (3) stanovili, že živiny, ako sú lyzíny a kyselina askorbová, môžu pôsobiť ako prírodné inhibítory ECM protoanalýzy a že majú potenciál ovplyvňovať rast a expanziu nádorov. Tieto živiny môžu uplatňovať svoje protinádorové účinky rôznymi mechanizmami. Patrí sem inhibícia MMP a posilnenie spojivového tkaniva, ktoré obklopuje rakovinové bunky (účinok enkapsulácie nádoru). V predchádzajúcej štúdii sme demonštrovali tento antiproliferatívny a antiinvazívny potenciál lyzínu, kyseliny askorbovej, prolínu a epig lukatechín galátu (ECGC) na ľudský karcinóm prsníka (MDA-MB 231), bunky rakoviny hrubého čreva (HCT 115) a bunky melanómu ( A2058) (4). Synergia živín tiež potlačila rast týchto nádorov bez negatívnych účinkov na holé myši. V súčasnej štúdii sme skúmali protinádorový potenciál synergie živín in vitro na typoch ľudských buniek osteosarkómu U-2 OS.
Stanovenie cieľov
Skúmali sme vplyv synergie živín (NS) na bunky ľudského osteosarkómu U-2 OS meraním cytotoxicity a regulácie matrixových metaloproteináz (MMP), MMP-2 a MMP9, ako aj invazívneho potenciálu.
Metódy a látky
Bunkové kultúry
Ľudské bunky osteosarkómu U-2 OS sa získali z ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) a pestovali sa v McCoyovom médiu doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom, penicilínom (100 U/ml) a streptomycínom (100 mg/ml) ) na 24-jamkových kultivačných platniach (Costar, Cambridge, MA). Bunky sa inkubovali s 1 ml média pri 37 ° C v inkubátore pre tkanivové kultúry (inkubátor) s 95% vzduchu a 5% C02, ktoré zostali rovnaké. Pri sútoku boli bunky ošetrené nutričnou synergiou, rozpustené v médiu a testované pri 0, 10, 100 a 1000 mM, každá dávka v troch opakovaniach. Doštičky sa potom umiestnili späť do inkubátora. Cytotoxicita reagencií bola skontrolovaná po nasledujúcich 24 hodinách inkubácie.
Test MTT
Životaschopnosť/cytotoxicita sa hodnotila po proliferácii buniek testom MTT v médiu bez séra aj v médiu doplnenom 10% PBS. Bunky bez séra z buniek boli odstránené a testované na MMP. Bunky v jamkách sa premyli fosfátom zmiešaným soľným roztokom (PBS) a do každej jamky sa pridalo 500 ml MTT (Sigma # M-2128) 5 mg/ml v PBS. Kultivačné doštičky sa inkubovali pri 37 ° C ďalšie 2 hodiny. Médium sa opatrne odsalo a ku každému sa pridal 1 ml DMSO (dimetylsulfoxid), aby sa rozpustili modré formazanové kryštály, ktoré sa vytvorili. Optická hustota sa merala pri 590 n. OD 550 DMSO roztoku v každej jamke sa sledoval priamo na spektrofotometri BioSpec 1501, Shimadzu. OD 590 DMSO roztoku v každej jamke sa považovala za proporcionálnu k počtu buniek. OD 590 kontroly (ošetrenie bez pridania) sa považovalo za 100%.
Zymografia želatinázy
Expresia MMP v predvolenom médiu sa stanovila pomocou želatinázovej zymografie. Zymografia želatinázy sa vystavila na 10% polyakrylamidovom géli (Bio-Rad, Hercules, CA) v prítomnosti 0,1% gélu. Naplnilo sa kultivačné médium (20 ml) a SDS-PAGE sa vystavila s Tris-glycínovým pufrom. Po elektroforéze boli gély premývané 5% Tritonom X-100 počas 30 minút. Po premytí sa gély inkubovali 24 hodín pri 37 ° C v prítomnosti 50 mM Tris-HCl, 5 mM CaCI2, 5 mM ZnCl2, pH 7,5 a 30 minút s Coomessie blue R 0,5. % zafarbené a opäť zafarbené. Proteínové štandardy boli nepretržite sledované a bola stanovená približná molekulová hmotnosť.
Matrigel Invasion Studies
Invazívne štúdie sa uskutočňovali použitím inzertov Matrigel (Becton Dickinson) na 24-jamkové doštičky. Bunky osteosarkómu suspendované v roztoku média s obsahom živín, ako je to špecifikované v koncepcii experimentu, boli umiestnené do inzertu do jamiek. Médium na vložke aj v miskách dostalo rovnaké prísady. Doštičky s inzertmi sa potom inkubovali v kultivačnom inkubátore vyváženom s 95% vzduchom a 5% CO2 počas 24 hodín. Po inkubácii bolo médium z jamiek odstránené. Bunky na hornom povrchu vankúšikov boli opatrne zoškrabané vatovými tampónmi. Bunky, ktoré prenikli cez membránu Mitragel a migrovali na spodný povrch matrigelu, boli zafarbené hematoxylínom a eozínom a opticky spočítané pod mikroskopom.
Tabuľka 1 - Zloženie synergie živín
Zásobný roztok výživnej synergie, zložený podľa pomerov uvedených nižšie, sa rozpustil v médiu, ako je uvedené v koncepcii experimentu na ošetrenie buniek.
Štatistická analýza
Výsledky boli uvedené ako stredné hodnoty + SE pre skupiny. Údaje sa analyzovali nezávislým testom „T“.