Úloha endotelových progenitorových buniek u pacientov s axiálnou spondyloartropatiou - PDF
1 Z kliniky pre nefrológiu a reumatológiu (prof. Dr. med. GA Müller) Lekárskej fakulty Univerzity v Göttingene Úloha endotelových progenitorových buniek u pacientov s axiálnou spondyloartropatiou INUUGURAL DISSERTATION pre získanie doktorského titulu na Lekárskej fakulte Univerzity Georga Augusta zu Göttingen predstavila Maria Elisabeth Vogt, rodená Struve z Frankfurtu nad Odrou Göttingen 2018
2 Dekan: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer Rečník: Spolupredseda: Tretí rečník: Priv.-Doz. DR. med. Susann Patschan prof. Dr. med. Rotraut Mößner prof. Dr. med. Margarete Schöm Dátum ústnej skúšky: 12. júna 2019
3 Týmto prehlasujem, že som vypracoval dizertačnú prácu s názvom Úloha endotelových progenitorových buniek u pacientov s axiálnou spondyloartropatiou a že som nepoužil iné zdroje alebo pomôcky ako tie, ktoré som uviedol. Osnabrück,.
4 Obsah zoznamu obrázkov. VI Zoznam tabuliek. VII Zoznam skratiek. VIII 1. Úvod a ciele Úvod Spondyloartritída a axiálna spondyloartropatia Definícia a anamnéza Epidemiológia/priebeh ochorenia Patogenéza Klinika a priebeh Diagnostika Fyzikálne vyšetrenie Skóre Klasifikačné kritériá Zobrazovacie laboratórium Terapia/manažment AS Ateroskleróza/kardiovaskulárne riziko u pacientov s axilárnou endoteliálnou vaskulogenézou a angiogenézou Endoteliálna dysfunkcia Experimentálny popis; Izolácia a kultivácia EPC a rôznych cytokínov Ďalšie stimulanty a inhibičné faktory na počet EPC EPC v kontexte patologických stavov Stav výskumu Materiál a metódy Kolektív pacientov a získavanie údajov Stanovenie skóre EPC a metódy klinického vyšetrenia IV
5 3.4 Štatistické hodnotenie kolektívnych výsledkov pacientov Výsledky testu CFU Hill FACS analýza Vasomodulačné mediátory Kurz Diskusia Súhrn Príloha Bibliografia V
7 Zoznam tabuliek Tabuľka 1: Zoznam použitého spotrebného materiálu 38 Tabuľka 2: Súhrn použitých nástrojov/prístrojov 39 Tabuľka 3: Zoznam použitých reagencií 39 Tabuľka 4: Popisná štatistika základných charakteristík kolektívu pacientov 46 Tabuľka 5: Klinické merania na hodnotenie pohyblivosti chrbtice/priebehu ochorenia 46 Tabuľka 6: Popisná štatistika počtu CFU-EC v skupine pacientov a kontrolnej skupine 47 Tabuľka 7: Zoznam p-hodnôt pre počet CFU-EC klasifikovaných podľa rôznych premenných/charakteristík 48 Tabuľka 8: Popisná štatistika počtu CFU-EC, klasifikovaných podľa pohlavia 49 Tabuľka 9: Popisná štatistika počtu CFU-EC, klasifikovaných podľa ASDAS 52 VII
8 Zoznam skratiek acldl = acetylovaná nízkohustotná lipoproteínová ankylóza = úplné stuhnutie kĺbu AS = ankylozujúca spondylitída = ankylozujúca spondylitída ASAS = hodnotenie medzinárodnej spoločnosti Spondyloartritída ASDAS = skóre aktivity ankylozujúcej spondylitídy axspa = kúpanie spondylartropatia Basit = ankylozujúca spondylitíza Funkčný index BASG = Globálne skóre ankylozujúcej spondylitídy v kúpeli BASMI = Metrologický index ankylozujúcej spondylitídy v kúpeli BSA = albumín hovädzieho séra BSG = rýchlosť sedimentácie CAC = cirkulujúca angiogénna bunka CD = zhluk diferenciácie CEC = cirkulujúca endoteliálna bunka, cirkulujúca endoteliálna bunka CFU = zápalové ochorenie čriev tvoriaca jednotka CFU-EC = kolónia tvoriaca jednotka - endoteliálna bunka CPC = cirkulujúca progenitorová bunka CRP = C-reaktívny proteín DMARD = antireumatikum modifikujúce chorobu ECFC = bunka tvoriaca endoteliálne kolónie ELISA = enzýmovo viazaný imunosorbent nt Assay Enthesitis = zápal v oblasti úponov šliach, väzov alebo kapsúl EC = endotelové bunky ecfc = neskoré výrastky EPC EPC = endotelová progenitorová bunka VIII
9 ESSG = Európska študijná skupina pre spondyloartropatiu FACS = fluorescenčné aktivovanie triedenia buniek FBA = vzdialenosť medzi prstami FLK-1 = VEGF receptor-2 CD309 KDR HDL = lipoproteín s vysokou hustotou HLA = ľudský leukocytový antigén HSC = hematopoetická kmeňová bunka IL-6 = Interleukin-6 KDR = receptor inzertnej domény kinázy CHD = ischemická choroba srdca LDL = lipoproteín s nízkou hustotou LWS = bedrová chrbtica MC = myeloidné kmeňové bunky MRT = zobrazovanie pomocou magnetickej rezonancie NO = oxid dusnatý NSAID = nesteroidné protizápalové lieky nr-axspa = non-fosfát-artografická-axialhritída-PBS = soľný roztok PDGF = rastový faktor odvodený z krvných doštičiek PPI = inhibítory protónovej pumpy RA = reumatoidná artritída SDF-1 = faktor odvodený zo stromálnych buniek 1a SpA = spondyloartritída, spondyloartropatia, spondyloartropatia TGF = transformujúci rastový faktor TPC = progenitorová bunka rezidentná v tkanive IX VEGF = vaskulárny endoteliálny rastový faktor IX
11 Boli skúmané tieto otázky: 1. Akú úlohu hrajú EPC pri axiálnej spondyloartropatii? 2. Zmenil sa ich počet alebo funkčnosť v porovnaní so zdravou kontrolnou skupinou? 3. Koreluje počet alebo funkcia EPC so závažnosťou klinického priebehu, použitou liekovou terapiou alebo aktivitou ochorenia? 4. Hrajú EPC úlohu v progresii ochorenia u jednotlivého pacienta? Dúfame, že výsledok našej štúdie môže mať vplyv na terapeutické možnosti alebo prognostické parametre. 2
19 Významne nepriaznivé prognostické faktory podľa francúzskej štúdie sú okrem koxitídy aj ESR> 30, slabá odpoveď na liečbu NSAID, obmedzená pohyblivosť bedrovej chrbtice, skorý nástup ochorenia (pred 17. rokom veku), orgánové prejavy alebo oligoartritída (Puchner 2012). Negatívny vplyv na priebeh má aj konzumácia a zanedbávanie nikotínu alebo iba občas vykonaná fyzioterapia. Úmrtnosť je obzvlášť vysoká v dôsledku zvýšeného kardiovaskulárneho rizika (Manger a Schulze-Koops 2012). 10
24 TNF-α blokátorov spôsobuje úplnú remisiu u viac ako 50% pacientov s axiálnou spondyloartropatiou (Barkham et al. 2009). Všetky merania pokroku (BASDAI, BASFI, BASMI) sa zlepšili po 24 a 102 týždňoch a parametre zápalu sa normalizovali (Braun a Sieper 2007). Podľa Haroon a kol. (2013) sa zdá, že terapia blokátormi TNF-α, najmä keď sa začína v počiatočnom štádiu ochorenia, znižuje rádiografický pokrok. Chirurgická liečba je možnosťou iba pre vybraných pacientov s telesným postihnutím, napríklad s nestabilnou chrbticou. Okrem farmakologickej terapie majú zásadnú úlohu aj iné ako liekové opatrenia, najmä fyzioterapia. Štúdie ukazujú, že ak sa cvičebná terapia vykonáva pravidelne, je možné preukázať zlepšenie fyzických funkcií, bolesti a celkovej pohody (Dagfinrud et al. 2008). 15
48 materiálov Zariadenie CO2 INKUBÁTOR (vykurovacia skriňa) Pipety Eppendorf Mraznička s mrazničkou FACS-Calibur Mikroskop: Mikroskop na inverznú inverznú bunkovú kultúru Olympus IX-81 sterilná lavica Čistý vzduch typ CA/R Vortex Genie 2 centrifúga: Megafuge 1,0 R centrifúga: Rotixa/A výrobca Sanyo Eppendorf AG, Hamburg Becton Dickinson Sanyo Liebherr Leica Microsystems Olympus Biohazard Bodo Schmidt GmbH Heraeus instruments GmbH Hettich Tabuľka 2: Súhrn použitých nástrojov/prístrojov Látka Katalógové číslo výrobcu Biocoll 1,0777 g/ml Biochrom AG, Belin L6115 BSA ph 7.0 Molekulárne sondy LabClinics SA K Dil AcLDL L3484 Endocult Basal Medium StemCell Technologies Inc Endocult Supplement StemCell Technologies Inc FcR Blocking Reagent Millenyi Biotec Fibronectin FLK = mouse-anti-human R&D Systems, Minneapolis FAB 357F VEGFR2 Formalin Hydrochloride Lectin from Ulex europaeus SIGMA-ALDRICH L9006-1 L9006-1 PE protilátky Jackson Immunoresearch, Baltimore, USA Tabuľka 3: Zoznam použitých reagencií 39
50 Vzdialenosť medzi prstami a podlahou (FBA) Pacient sa ohýba dopredu, pokiaľ je to možné, s rovnými nohami. Meria sa vzdialenosť medzi špičkou prostredného prsta a podlahou. Táto nameraná hodnota sa používa na hodnotenie chrbtice, bedrových kĺbov a ischiokrurálnych svalov. Na klinike sa často používa na sledovanie pokroku (Feldtkeller a van der Heijde 2005). Bočný sklon chrbtice Pri stojacom pacientovi sa meria vzdialenosť medzi podlahou a predĺženým hrotom prostredníka na tele. Vykoná sa nové meranie s maximálnym bočným sklonom, s nohami stále rovnými (bez rotácie!). Priemerná hodnota je tvorená rozdielom medzi prvou a druhou hodnotou nameranou pre obe strany (norma> 10 cm) a používa sa na výpočet BASMI (van der Heijde et al. 2008). Obrázok 10: Schematické znázornenie bočného sklonu chrbtice (podrobnosti o meraní nájdete v texte) Vzdialenosť členku Toto opatrenie sa používa na hodnotenie pohyblivosti bedrového kĺbu. Pri ležiacom pacientovi sa vzdialenosť medzi vnútornými členkami meria s čo najširšími nohami (predĺžené kolená, prsty smerujúce nahor) (norma> 100 cm). Táto hodnota je zahrnutá v BASMI (Feldtkeller a van der Heijde 2005). 41
51 Vzdialenosť steny tragusu Toto meranie sa používa na hodnotenie kyfózy. Vzdialenosť medzi tragusom a stenou sa meria s pacientom vzpriameným chrbtom a pätami pri stene a je tiež súčasťou prístroja BASMI (Feldtkeller a van der Heijde 2005). Obrázok 11: Schematické znázornenie vzdialenosti steny tragusu (podrobnosti o meraní nájdete v texte) Rotácia krčnej chrbtice Keď pacient sedí vzpriamene a pozerá sa priamo pred seba, hlava sa otáča čo najviac doprava a doľava (štandardne > 70). Na výpočet BASMI sa použije uhol medzi maximálnou rotáciou a nulovou polohou. Ramená sa nesmú krútiť súčasne (Feldtkeller a van der Heijde 2005). BASMI Index metrológie ankylozujúcej spondylitídy pre kúpeľ je tvorený rôznymi klinickými meraniami na vyhodnotenie pohyblivosti chrbtice a akýchkoľvek obmedzení. Patria sem upravené Schoberove opatrenia, bočný sklon bedrovej chrbtice, maximálna vzdialenosť členku, vzdialenosť steny tragusu, rotácia krčnej chrbtice (výpočet pozri v prílohe). Tento index bol zavedený v anglickom meste Bath v roku 1994. V 42
53 3.4 Štatistické vyhodnotenie Výsledky boli vyhodnotené pomocou programu STATISTICA od statsoft. Najskôr sa dáta testovali na normálnu distribúciu pomocou Shapiro-Wilks-W testu. Statistica používa rozšírenie tohto testu, ktoré opísal Royston 1992. Zhromaždené údaje nie sú normálne rozdelené. Ďalej boli pomocou programu STATISTICA vytvorené popisné štatistiky, najmä s priemerom a štandardnou odchýlkou. Pretože neexistuje normálne rozdelenie, na testovanie štatistickej významnosti sa použili neparametrické metódy. Použil sa na to Mann-Whitneyov U test. Na rozdiel od normálneho t-testu s normálnym rozdelením to nie je založené na priemerných hodnotách, ale na základe poradia. Významný rozdiel, to znamená prílišná asociácia, bol definovaný s hodnotou p pod hladinou významnosti 0,05. Na ilustráciu vzťahov medzi rôznymi premennými sa korelačný koeficient vypočítal pomocou Spearmanovho R, rovnako ako hladina významnosti. Na ilustráciu výsledkov boli vytvorené škatuľkové grafy a bodové grafy. 44
64 CFU-EC a fajčenie Existuje trend smerom k nižšiemu počtu CFU-EC u fajčiarov. Rozdiel oproti nefajčiarom však nie je štatisticky významný (p = 0,37). 70 Box-Whisker-Plot Spotreba CFU a nikotínu Priemerná hodnota CFU + SD: spotreba nikotínu žiadna spotreba nikotínu spotreba nikotínu žiadna spotreba nikotínu priemerná hodnota spotreby nikotínu ± stdf. Priemerná hodnota ± 1,96 * stdf. Krajné extrémne hodnoty Obrázok 18: Počet CFU-EC, klasifikovaných podľa spotreby nikotínu 55
65 4.3 FACS analýza Na kvantitatívne vyhodnotenie cepcs boli pripravené vzorky pacientov a analyzované pomocou FACS zariadenia. Dvojito pozitívne bunky pre CD133 a FLK zodpovedajú cepcs. V porovnaní so zdravou kontrolnou skupinou tu nie je vidieť žiadny významný rozdiel. Priemer a medián sú takmer identické (p = 0,69, N pacientov = 49, N kontrolná skupina = 10). Tiež nebolo možné preukázať štatisticky významnú koreláciu medzi nameranými CFU-EPC a CD133 +/FLK + bunkami meranými pomocou FACS. 8 Schéma box-whiskeru pre pacientov s dvojitými pozitívnymi bunkami CD133/FLK a kontrolná skupina 7 6 Priemerných + SD 6 pozitívnych buniek CD133/FLK: pacienti - 0,97 + 1,65 kontrolná skupina - 0,75 + 0, priemerná kontrolná skupina pacientov priemer ± Stdf. Priemerná hodnota ± 1,96 * stdf. Krajné extrémne hodnoty Obrázok 19: cepcs (v%) u pacientov a kontrolnej skupiny. 56
FACS a aktivita ochorenia Rozdelenie cepcs podľa aktivity ochorenia, merané pomocou BASDAI, ukázalo štatisticky nevýznamnú tendenciu k vyššiemu počtu cepcs s vysokou aktivitou ochorenia (zodpovedá BASDAI> 4; p = 0,1). FACS a pohlavie Klasifikácia cepkov meraná FACS podľa pohlavia nepreukázala žiadny významný rozdiel (p = 0,08). U pacientov mužského pohlavia je tendencia k nižšiemu počtu cepkov. 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 Box-Whisker-Plot Počet EPC (v%) rozdelených podľa pohlavia EPC 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 Priemer + SD: Ženy 1,45 + 2,3 muži 0,62 + 0,8 0,4 ženy muži stredný priemer ± stdf. Priemerná hodnota ± 1,96 * stdf. Obrázok 20: cepy (v%) klasifikované podľa pohlavia 4,4 vazomodulačné mediátory Rozdiely medzi koncentráciami rôznych vazomodulačných mediátorov (VEGF, PDGF, TGF-β, angiopoetín -1 a -2) v kontrolnej skupine a u pacientov neboli štatisticky významné. 57