Úloha fosfolipidov a oxidovaných lipidov pri spracovaní amyloidového prekurzora

Z oblasti experimentálnej neurológie, teoretickej medicíny a biologických vied Lekárskej fakulty Univerzity v Sársku Homburg/Saar Dôležitosť fosfolipidov a oxidovaných lipidov pre spracovanie proteínu prekurzora amyloidu (APP) a dizertačnej práce o Alzheimerovej chorobe na získanie titulu doktorát Prírodné vedy Lekárskej fakulty SAARLANDSKEJ UNIVERZITY 2016 predniesla Viola J. Hauptenthal narodená 24. augusta 1982 v Saarbrückene

úloha

(3.2.9) Stanovenie aktivity α-sekretázy a ADAM-10 po inkubácii in vitro 25 (3.2.10) Stanovenie obsahu Ap, sappβ a sappα. 26 (3.2.11) Stanovenie obsahu ADAM-17, BACE-1 a PS-1. 27 (3.3.) Analýza lipidov. 28 (3.3.1) Extrakcia lipidov z ľudských post-mortem mozgov. 28 (3.3.2) Meranie stability DHA. 28 (3.3.3) Stanovenie obsahu lipidov hmotnostnou spektrometriou. 28 (3.3.4) Stanovenie obsahu fosfolipidov pomocou tenkovrstvovej chromatografie. 29 (3.3.5) Stanovenie obsahu HNE. 30 (3.3.6) Stanovenie peroxidácie lipidov. 30 (3,4) RNA analýza. 31 (3.4.1) Izolácia RNA. 31 (3.4.1) syntéza cdns a polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (RT-PCR). 31 (3.5) Štatistické hodnotenie. 32 (4) publikácií. 33 (4.1) Zhrnutie publikácie 1 a opis spoluúčasti. 33 (4.2) Zhrnutie publikácie 2 a opis spoluúčasti. 69 (4.3) Zhrnutie publikácie 3 a opis spoluúčasti. 87 (5) Rozšírené zhrnutie. 102 (5.1) Lipidy v AD. 102 (5.2) V kontexte: fosfolipidy, DHA a oxidované lipidy pri spracovaní APP a ich úloha v AD. 104 (6) Zhrnutie a Outlook. 117 (7) Účasť na iných publikáciách. 119 (8) Bibliografia. 121 (C) Poďakovanie. 133

Skratky (B) Skratky C stupne Celzia µm mikromolárna kyselina AA arachidónová Aβ amyloid P AD Alzheimerova choroba ADAM a-sekretáza A-dezintegrant a metaloproteáza AICD intracelulárna APP doména Aph engl. Predný defekt hltanu APO E apolipoproteín E APP amyloidný prekurzorový proteín BACE β-sekretáza BSA hovädzí sérový albumín COX cyklooxygenáza CTF C-koncová doména APP DHA kyselina dokosahexaénová DMEM Dublecco s modifikovaným orlím médiom DNA deoxyribonukleová kyselina endotelín-konvertujúci enzým ETE endotelín-konvertujúci enzým Kyselina etylénglykoltetraoctová EOAD Skorá forma Alzheimerovej choroby EPA Kyselina eikosapentaénová FAD Familiárna forma Alzheimerovej choroby FCS Sérum fetálneho teľaťa g/g gram/zrýchlenie vďaka gravitácii GSK3β Glykogénsyntáza kináza 3 hodiny HBSS Soľný tlmivý roztok pre primárne neuróny 3 H-H-GCR Hydroxy-D 3-metylglutaryl koenzým A reduktáza 5

Skratky HNE 4-Hydroxynonenal HPLC vysokoúčinná kvapalinová chromatografia IDE Inzulín degradujúci enzým IP imunoprecipitácia LDH meranie laktátdehydrogenázy LDL lipoproteín s nízkou hustotou LOAD Neskorá forma Alzheimerovej choroby LOX lipoxigenáza LRP1 lipoproteínový receptor 1 minúta minúta Me metanol 40 mm milimolárny roztok NP-40 NP 1 neuroprotektín-D1 NTF neurofibrilárne klbká OD optická hustota P p-hodnota, hladina významnosti PBS fosfátom pufrovaný soľný roztok PC fosfatidylcholín PE fosfatidyletanolamín PL plazmalogén PS fosfatidylserín PSEN angl. Zosilňovač presenilínu RIP regulovaná intramembránová proteolýza RNS ribonukleová kyselina RT izbová teplota RT-PCR polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase SAD sporadická forma Alzheimerovej choroby miazga rozpustná APP druhá SDS dodecylsulfát sodný PAGE polyakrylamidová gélová elektroforéza SPT serín palmitoyl-koenzým Wtiobaráza 6 divoký typ TBA

Úvod Po rozštiepení a-sekretázy sa membránovo viazaný αctf štiepi y-sekretázou, ktorá uvoľňuje malý fragment p3 v cytosolickom AICD a extracelulárne. Na rozdiel od amyloidogénnej cesty sa AICD z neamyyloidogénnej cesty odbúrava v bunke okrem iného aj enzýmom degradujúcim inzulín (IDE), a preto je transkripčný význam tohto AICD kontroverzný (Belyaev et al. 2010). Funkcia p3 je stále nejasná. Prehľad spracovania APP je uvedený na obrázku 1. Obrázok 1 Schematické znázornenie spracovania APP upravené z (Grimm, Rothhaar & Hartmann 2012). Neamyloidogénne spracovanie zobrazené vyššie vpravo je prevzaté α- (zelená) a y-sekretáza (modrá). Na začiatku sa tvoria rozpustný sappα a actf na báze membrány. Potom sa vytvoria p3 a AICD. Ap je v aplikácii APP označený červenou farbou. Amyloidogénne spracovanie je zobrazené vľavo dole. P-sekretáza štiepi APP, čo vedie k sappβ a pctf. Potom sa β-sekretáza uvoľní Ap a AICD. 16

Publikácie lipidov v bunkách a izolovaných membránach, ktoré uskutočnil S. Grösgen (obrázok S5), som uskutočnil inkubáciu lipidov. Na stanovenie obsahu PC, PE a PS pomocou tenkovrstvovej chromatografie, ktorú vykonal B. Hundsdörfer (obrázok S2), a na stanovenie lipidového profilu, ktorý uskutočnil S. Grösgen (tabuľka S5), mám membrány od SH Izolované bunky -SY5Y a ľudské postmortálne mozgy. Štatistickú analýzu dát som uskutočnil pomocou ANOVA v spolupráci s V. Zimmerom a J. Lehmannom (obrázok 1-4, tabuľka S1-4). Publikáciu 1 nájdete nižšie. Originál publikácie je možné nájsť na webových stránkach vydavateľa MDPI AG (Bazilej, Švajčiarsko), www.mdpi.com/journal/ijms, pod číslom doi: 10,3390/ijms14035879. 35

Dodatok Rothhaar a kol., Publikácia Obr. S1 Cytotoxicita po lipidovej inkubácii Obr. S2 Kontrola špecifickosti v teste -secretázy Obr. S3 Kontrola špecifickosti v teste -secretázy cytotoxicita 5 4 3 2 1 [%] n.s. n.s. kontrola fluorescencie (aktivita -sekretázy) [RFU] + inhibítor-sekretázy kontrola fluorescencie (aktivita -sekretázy) [RFU] kontrola + inhibítora-sekretázy PC 22: 6 PC-PL 22: 6 PE 22: 6 PE-PL 22: 6 0 2000 4 000 6 000 8 000 čas [s] 0 1000 2000 3000 4 000 5 000 čas [s] Obr. S4 Kontrola špecificity v teste -secretase fluorescencia (-secretase activity) [RFU] kontrola + -secretase inhibitor 0 2000 4000 6000 time [sec] 86

Publikácie Okrem analýzy v živých bunkách som uskutočnil inkubáciu membrán z buniek SH-SY5Y a následné meranie aktivity β-sekretázy a štatisticky som vyhodnotil údaje (obrázok 2c). Stanovenie expresie sekretáz bolo uskutočnené J. Mettom po mojej inkubácii buniek s oxidovanými lipidmi (obrázok 2d). T. Blümel stanovil aktivitu β- a y-sekretázy po inkubácii s DHA (výsledky v texte) a C. Stahlmann DHA stabilita (výsledky v texte); U obidvoch analýz som uskutočnil inkubáciu s lipidmi. Štatistické vyhodnotenie hladín Ap po inkubácii s DHA a oxidovanými lipidmi bolo vykonané N. Mylonasom (výsledky v texte). Publikáciu 3 nájdete nižšie. Originál publikácie je možné nájsť na webových stránkach vydavateľa S. Karger AG (Bazilej, Švajčiarsko), www.karger.com/ndd, pod číslom doi: 10.1159/000440839. 89