Vírus hepatitídy typu C s genotypizáciou - Synevo

Všeobecné informácie a odporúčania

vírus

Vírus hepatitídy C (HCV) je patogén s globálnou prevalenciou a hlavnou príčinou chorobnosti a úmrtnosti. Podľa posledných odhadov sa séroprevalencia HCV zvýšila za posledných 15 rokov na 2,8%, čo zodpovedá> 185 miliónom infekcií na celom svete. Pretrvávajúca infekcia HCV je spojená s rozvojom cirhózy pečene, hepatocelulárneho karcinómu a zlyhania pečene s vysokou mierou úmrtia.

Rovnako ako iné RNA vírusy, aj HCV má značnú genetickú diverzitu na nukleotidovej úrovni, čo je hlavným problémom tak pre vývoj vakcín proti HCV, ako aj pre pangenotypové terapie.

Na základe fylogenetickej analýzy genómovej sekvencie sú kmene HCV v súčasnosti klasifikované do 7 odlišných genotypov (HCV 1-7), ktoré sa navzájom líšia v nukleotidových sekvenciách o 30 - 35% a vo viac ako 50 podtypoch, z ktorých registruje rozdiel 15-25%. Okrem toho u infikovaných jedincov HCV cirkuluje a správa sa ako zmes odlišných vírusových populácií nazývaných kvázi druhy 1; 2 .

Genóm HCV je tvorený doménami, ktoré sa veľmi líšia rýchlosťou mutácií a variabilitou nukleotidových sekvencií. Neprekladaná oblasť na 5 'konci genómu (5'UTR) je teda najzachovalejšou doménou s najpomalšou evolučnou rýchlosťou. Potom nasleduje C (jadro) gén, ktorý kóduje nukleokapsidové jadro proteínu a ktorý sa vyvíja trikrát rýchlejšie v porovnaní s oblasťou 5'UTR. Gény kódujúce škrupinové proteíny E1 a E2 tvoria hypervariabilnú oblasť, ktorá sa líši od jedného izolátu k druhému. Toto umožňuje vírusu obísť imunitné mechanizmy hostiteľa namierené proti prístupným proteínom vo vírusovom obale. .

Podľa posledných údajov o celkovej prevalencii HCV je najrozšírenejší genotyp 1 (46,2% všetkých prípadov infekcie HCV), za ktorým nasleduje genotyp 3 (30,1%); genotypy 2, 4 a 6 sú zodpovedné za 22,8% prípadov a genotyp 5 za 1 .

U nás prevláda genotyp 1b a zmes genotypov 1a a 1b 4. Štúdia uskutočnená na inštitúte Matei Balş v Bukurešti na 670 pacientoch ukázala 99,7% prevalenciu HCV genotypu 1 5 .

Cieľom antivírusovej liečby je liečiť infekciu HCV. Pretrvávajúca virologická odpoveď (SVR) je definovaná nedetegovateľnou HCV RNA 12 a 24 týždňov po ukončení liečby. Infekcia HCV sa lieči vo viac ako 99% prípadov, v ktorých sa získalo SVR. U pacientov bez cirhózy je SVR zvyčajne spojená s ústupom ochorenia pečene, zatiaľ čo u pacientov s cirhózou môže síce fibróza pečene ustupovať a riziko rozvoja zlyhania pečene a portálnej hypertenzie je znížené, avšak riziko hepatocelulárneho karcinómu nie je úplne eliminované.

Do roku 2011 bola liečba založená na kombinácii pegylovaného interferónu α s ribavirínom, pričom miera odpovede bola odlišná v závislosti od genotypu HCV. Týmto terapeutickým prístupom sa pre HCV genotyp 1 dosiahla miera RVS približne 40% v Severnej Amerike a 50% v západnej Európe. Vyššie hodnoty RVS (až 80%) sa dosiahli pre genotypy 2, 3, 5 a 6, zatiaľ čo pre genotyp 4 sa dosiahli stredné hodnoty RVS 6 .

Začiatkom roku 2015 Európska komisia povolila uvedenie na trh nového lieku - Viekirax + Exviera, a liečba bola schválená na podávanie s alebo bez ribavirínu pacientom s chronickou infekciou HCV genotypu 1, vrátane pacientov s kompenzovanou cirhózou pečene, pacientov súbežne infikovaných HIV-1, pacientov podstupujúcich liečbu závislosťou od opiátov a pacientov liečených transplantáciou pečene. . Liek bol navyše schválený v kombinácii s ribavirínom pre pacientov s chronickou hepatitídou C genotypu 4. Viekirax pozostáva z kombinácie fixnej ​​dávky paritapreviru 150 mg (inhibítor proteázy NS3/4A) a ritonaviru 100 mg (inhibítor CYP3A4, ktorý zvyšuje paritaprevir) v kombinácii s 25 mg ombitasviru (inhibítor NS5A) jedenkrát denne a Exviera pozostáva z 250 mg dasabuviru (nenukleozidový RNA-dependentný RNA polymerázový inhibítor) podávaného dvakrát denne s alebo bez ribavirínu . Táto kombinácia antivírusových látok bez interferónu sa synergicky zameriava na replikáciu HCV na 3 rôznych úrovniach. Podľa výsledkov 6 štúdií fázy III a 2 štúdií fázy II bola celková SVR po 12 týždňoch u pacientov infikovaných genotypom 1 vyššia ako 96% 6; 7 .

Na záver sa odporúča, aby sa genotypovanie HCV uskutočnilo pri všetkých infekciách vírusom C pred začiatkom akejkoľvek liečby, aby sa vybral vhodný protokol. .

Test vykonaný v našom laboratóriu využíva na identifikáciu genotypov techniku ​​RT-PCR (reverzná transkripcia cieľovej RNA s generovaním komplementárnej DNA, ktorá bude amplifikovaná pomocou PCR reakcie s detekciou amplikónu v reálnom čase) a fluorescenčne označené oligonukleotidové sondy špecifické pre každý genotyp. HCV 1 až 6 a podtypy a a b genotypu 1 8 .

Odobratý exemplár - venózna krv 8 .

Zberová nádoba - vacutainer obsahujúci EDTA ako antikoagulant 8 .

Po zbere potrebné spracovanie - plazmu oddeľte odstredením 8 .

Objem vzorky - minimálne 1 ml plazmy 8 .

Stabilita vzorky - vzorky plazmy sú stabilné 1 mesiac pri -20 ° C 8 .

Metóda - PCR v reálnom čase na automatickej platforme m2000 (Abbott); test používa ako amplifikačné ciele sekvenciu z 5'UTR oblasti vírusového genómu na detekciu genotypov 1-6 a oblasť NS5B na samostatnú identifikáciu podtypov 1a a 1b; Používajú sa 4 sady primérov vyžadujúce 3 typy samostatných reakcií:

  • reakcia A: deteguje všetky izoláty HCV, izoláty podtypu 1a a izoláty genotypu 3;
  • reakcia B: deteguje izoláty genotypu 2, podtypu 1b a genotypu 1;
  • reakcia C: deteguje izoláty s genotypmi 4, 5 a 6.

V čase prípravy každej vzorky od pacienta sa zavedie sekvencia RNA, ktorá nesúvisí s genómom HCV, a ktorá bude slúžiť ako vnútorná kontrola pre všetky fázy procesu. Kontrolné vzorky (pozitívne a negatívne) sa tiež používajú pri každom cykle vzoriek.

Presnosť testu bola preukázaná analýzou 162 izolátov HCV s genotypom 1 (110 s genotypom 1a a 58 s genotypom 1b), 41 izolovaných HCV genotypov 2, 27 izolovaných HCV genotypov 3, 28 izolovaných HCV genotypov 4, 14 izolovaných HCV genotypov 5 a 12 izolovaného genotypu HCV 6. Na stanovenie referenčného genotypu v každej analyzovanej vzorke sa použila technika sekvenovania nukleových kyselín. Zhoda medzi 2 metódami (PCR genotypizácia a sekvenovanie) bola 97,59% pre všetky identifikované genotypy, 97,27% pre podtyp 1a a 91,38% pre podtyp 1b 8. .

Limity a rušenie

Genotypovanie HCV sa neodporúča na skríning alebo potvrdenie infekcie HCV. Test je možný iba vtedy, ak existuje virémia C> 500 IU/ml.

Oligonukleotidová sonda zodpovedajúca 5’UTR oblasti HCV genómu genotypu 1 nereaguje krížovo so vzorkami obsahujúcimi podtyp HCV 6a, ale môže vykazovať krížovú reaktivitu s podtypom 6b a niektorými podtypmi non6a/6b genotypu 6.

V niektorých prípadoch možno dosiahnuť neinterpretovateľné výsledky z dôvodu heterogenity sekvencií genómu HCV, zmiešaných infekcií alebo (zriedkavej) existencie rekombinantných kmeňov HCV 8 .