Vplyv žírnych buniek na hojenie kože rán kože infikovaných Pseudomonas aeruginosa

Z kliniky pre dermatológiu, venerológiu a alergológiu Lekárskej fakulty Charité Universitätsmedizin Berlin DISZERTÁCIA Vplyv žírnych buniek na hojenie kožných rán kožnými ranami infikovanými Pseudomonas aeruginosa na získanie akademického titulu Doctor medicinae (Dr. med.) Prezentované Lekárskej fakulte Charité Universitätsmedizin Berlin Daniel Tröltzsch z Karl-Marx-Stadt/teraz Chemnitz Dátum doktorátu: 04.09.2015-1 -

buniek

Venované mojim rodičom Recenzent: 1. 2. 3. Dátum doktorátu. - 2. miesto -

Obsah Zhrnutie. Abstrakt. Stanovenie cieľov. 1. Úvod. 1 1.1. Základy biológie mastocytov. 1 1.1.1. Úvod. 1 1.1.2. Vlastnosti žírnych buniek. 2 1.1.3. Distribučný model a heterogenita. 3 1.1.4. Vznik a vývoj. 5 1.1.5. Fyziológia a funkcie žírnych buniek. 7 1.1.6. Imunologické kompetencie žírnej bunky. 11 1.2. Úloha mastocytov v prirodzenej imunite voči baktériám. 12 1.2.1. Všeobecné. 12 1.2.2. Baktéria Pseudomonas aeruginosa. 14 1.2.3. Antimikrobiálne peptidy a MZ proteázy, ako aj ich úloha v imunitnej obrane sprostredkovanej MZ. 15 1.3. Kožné hojenie rán. 16 1.3.1. Prehľad. 16 1.3.2. Fázy a mechanizmy hojenia rán. 17 1.3.3. Hojenie rán a žírne bunky - stav výskumu. 20 2. Materiál a metódy. 22 2.1. Zvieratá. 22 2.1.1. Model Kit W/Kit W-v - myš. 22 2.1.2. Rekonštitúcia. 23 2.2. Experiment s hojením rán u myší divokého typu a MZ-deficitných. 23 2.2.1. Anestézia. 23 2.2.2. Rany, infekcie a kontrola. 23 iii

2.2.3. Meranie rany. 24 2.2.4. Histológia. 25 2.3. Bakteriálne zaťaženie rany. 26 2.4. Bunky. 27 2.4.1. Získanie a kultivácia kultivovaných MZ (BMCMC) získaných z kostnej drene. 27 2.4.2. Získanie peritoneálnych žírnych buniek (PMC). 28 2.4.3. Separácia magnetických buniek (MACS). 28 2.4.4. Pestovanie PCMC. 28 2.4.5. Analýza FACS. 29 2.5. Kultivácia kultúry Pseudomonas aeruginosa. 30 2.6. Stanovenie p-hexosaminidázy. 30 2.7. Stanovenie miery prežitia baktérií. 31 2.8. Cytospin. 32 2.9. Kvantitatívna real-time PCR (q-rt-pcr). 32 2.9.1. Primer. 32 2.9.2. Stimulácia PCMC. 34 2.9.3. Izolácia RNA. 34 2.9.4. Stanovenie čistoty a koncentrácie RNA. 35 2.9.5. Prepíšte do CDNA. 35 2.9.6. Postup PCR s LightCycler. 36 2.10. Štatistická analýza. 37 3. Výsledky. 39 3.1. Priebeh hojenia rán u MZ-deficitných myší Kit W/Kit W-v po infekcii baktériou Pseudomonas aeruginosa je oneskorený. 39 3.2. Normálne hojenie rán rán infikovaných Pseudomonas aeruginosa závisí od žírnych buniek. 43 3.3. Histologické potvrdenie úspešnej rekonštitúcie myší MZ-deficitných Kit W/Kit W-v s BMCMC. 46 3.4. Zvieratá s ranami infikovanými PA nevykazujú žiadne systémové príznaky infekcie. 49 iv

3.5. MZ znižujú bakteriálnu záťaž rán infikovaných Pseudomonas aeruginosa. 51 3.6. Baktéria Pseudomonas aeruginosa a jej zložky nevedú k degranulácii kultivovaných peritoneálnych žírnych buniek (PCMC). 53 3.7. MC znižujú mieru prežitia baktérie Pseudomonas aeruginosa v kokultúre. 55 3.8. Detekcia expresie selekcie antimikrobiálnych peptidov a proteáz vylučovaných MZ po stimulácii LPS a PA. 57 3.9. Pseudomonas aeruginosa a LPS menia expresiu MZ-špecifických proteáz a antimikrobiálnych peptidov v malom rozsahu po 4 a 24 hodinách stimulácie. 59 3.10. Kultivované peritoneálne žírne bunky ako model pre kožné žírne bunky. 61 4. Diskusia. 64 5. Bibliografia. 77 6. Čestné vyhlásenie. 99 7. Životopis. 100 8. Poďakovanie. 101 pred Kr

Cieľ in vivo: 1. Prezentácia zmenenej tendencie hojenia rán divokého typu Kit +/+ - a MZ-deficientných myší Kit W/Kit Wv po infekcii baktériou Pseudomonas aeruginosa (pa) 2. Dôkaz závislosti MZ od bakteriálnych porúch hojenia rán rekonštitúciou MZ deficitné myši pomocou BMCMCs 3. Porovnávacie stanovenie bakteriálnej záťaže u rán myší Kit +/+ a Kit W/Kit Wv - po 24 hodinách infekcie PA in vitro: 4. Vyšetrovanie aktivácie MZ pomocou PA, ako aj podľa vybraných zložiek tejto baktérie 5. Kvantitatívna detekcia priamej eliminácie PA MZ v kokultúre 6. Identifikácia vylučovaných antimikrobiálnych peptidov alebo proteáz MZ po bakteriálnej stimulácii a kvantifikácia ich expresie pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase viii

Tabuľka 1 Vlastnosti myšej sliznice a mastocytov spojivového tkaniva (Galli, 1990) Sliznica MZ (MMC) Spojivové tkanivo MZ (CTMC) Výskyt Bronchiálny epitel, sliznica čreva Koža, pľúca, pobrušnica Životnosť Asi 40 dní Niekoľko mesiacov až rokov Ultraštruktúra granúl Malá, heterogénne elektrónovo hustá Veľký, homogénny, elektrónovo hustý vývoj závislý na T-bunkách Áno Nie Najvýznamnejší intragranulárny proteoglykán Chondroitín sulfát Heparín Môže byť zafarbený alziánskou modrou Alzianová modrá, berberín sulfát, safranín Obsah histamínu v granulách Nízky vysoký obsah serotonínu v granulách Nízky Variabilný prítomnosť vysokoafinitných IgE receptorov Áno Áno Nie Aktivácia zlúčeninou 48/80 Áno, v populáciách ľudských žírnych buniek sa rozlišuje expresný vzorec tryptázy a chymázy, dvoch známych proteáz žírnych buniek. Bunky pozitívne na tryptázu a chymázu sú lokalizované v koži, zatiaľ čo tryptázou pozitívne mastocyty dominujú v pľúcach (Irani a kol., 1986; Miller a Schwartz, 1989; Welle a kol., 1997). - 4. miesto -

PCR sa hodnotila pomocou relatívnej kvantifikácie na základe β-aktínu ako prevádzkového génu, pomocou ktorého bolo možné určiť pomer stimulovaných a nestimulovaných vzoriek (pomer) pomocou nasledujúcich vzorcov: Pomer = 2-ΔΔCt ΔΔCt = CCt (stimulovaný) - ΔCt ( nestimulované) ΔCt = Ct (cieľový gén) Ct (prevádzkový gén). Hodnota Ct (prahová hodnota cyklu) popisuje cyklus PCR, pri ktorom sa prvýkrát výrazne zvyšuje fluorescencia. 2.10 Štatistické analýzy Štatistické vyhodnotenie výsledkov tejto práce bolo uskutočnené pomocou nasledujúcej metódy: Výpočet priemernej hodnoty M: M 1 nnxii 1 n Počet nameraných hodnôt xi Hodnota nameranej hodnoty i Štandardná odchýlka SD strednej hodnoty: SD 1 n 1 nxi M i 1 2 Štandardná chyba SEM des Priemerná hodnota: SD SEM n - 37 -

Všetky súbory údajov boli analyzované na významnosť pomocou obojstranného Studentovho t-testu pre nespojené vzorky: Výpočet hodnoty: t M 2 1 1 1 SD n M 2 SD n 2 2 2 M 1: stredná hodnota vzorky 1 M 2: stredná hodnota vzorky 2 SD 1 Štandardná odchýlka stredných hodnôt populácie 1 SD 2 Štandardná odchýlka stredných hodnôt populácie 2 n 1 Počet nameraných hodnôt vo vzorke 1 n 2 Počet nameraných hodnôt vo vzorke 2 Hodnota pravdepodobnosti ([p]) p 0,05 ako nevýznamná zobrazené. Všetky údaje boli uvedené ako priemer ± SE. Štatistické analýzy sa uskutočňovali pomocou počítačového softvéru Statview (Statview pre Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). - 38 -

Obrázok 1a Kit +/+ (neinfikovaný) 1,5 cm 0 h 6 h 12 h Deň 1 Deň 2 Deň 3 Deň 4 Deň 5 Deň 6 Deň 7 Deň 8 Deň 9 Kit +/+ (infikovaný) 1,5 cm 0h 6h 12h Deň 1 Deň 2 Deň 3 Deň 4 Deň 5 Deň 6 Deň 7 Deň 8 Deň Obrázok 1b Kit W/Kit Wv (neinfikovaný) 1,5 1,5 cm cm 0 h 6 h 12 h Deň 1 Deň 2 Deň 3 Deň 4 Deň 5 Deň 6 Deň 7 Deň 8 Deň 9 Kit W/Kit Wv (infikované) 1,5 1,5 cm cm 0 h 6 h 12 h Deň 1 Deň 2 Deň3 Deň 4 Deň 5 Deň 6 Deň 7 Deň 8 Deň 9 Obrázok 1 a/b: Plocha rany u myší s deficitom MZ infikovaných Pseudomonas aeruginosa je zväčšená. Tieto rany boli infikované 10 ul suspenzie Pseudomonas aeruginosa (PA) v koncentrácii 6,5 x 105 PA/10 ul alebo 10 ul PBS ako negatívna kontrola a fotografované v opísaných časových intervaloch. Reprezentatívne obrázky uzavretia rany jedného zvieraťa v určených časoch sú zobrazené v identickej mierke 1,5 cm. Obrázok 1a divoký typ súpravy +/+ - myši, Obrázok 1b MZ-deficitný kit W/Kit W-v - myši. - 41 -

* ** ** * * * * * * Obrázok 2: Proces hojenia rán infikovaných Pseudomonas aeruginosa je u myší Kit W/Kit W-v s oneskorením oneskorený. Infikované myši Kit +/+ (n = 9), infikované myši MZ-deficitné Kit W/Kit Wv (n = 6) a zodpovedajúce kontroly (n = 10 alebo n = 6) boli jednotlivo ošetrení ranami v oblasti kaudálnej chrbtice Uzdravenie bolo zdokumentované. Obrázok zobrazuje proces hojenia rany počas 9 dní, vynesený ako percentuálna plocha rany, ktorá bola vpichnutá v deň 0. Údaje sú zhrnuté z 2 nezávislých experimentov, pričom n = 6 - 10 zvierat na skupinu a sú uvedené ako priemer ± SEM; * = p 1 zodpovedá napríklad tryptáze 1 pod LPS (2,9-násobok ± 1,3 SEM) a PA (2,2-násobok ± 0,3 SEM), katepsínu G pod LPS (2,2-násobok krát ± 1,0 SEM) a PA (1,4 krát ± 0,1 SEM), MCPT8 pod LPS (2,6 krát ± 0,8 SEM) a PA (1,6 krát ± 0,2 SEM) ), MCPT9 pod LPS (3,1-násobok ± 1,5 SEM), rovnako ako Granzym B pod LPS (2,0-násobok ± 0,6 SEM) a pod PA (2,9-násobok ± 1,5 SEM) . Naopak, expresia MCPT9 bola downregulovaná pod stimuláciou PA (0,7-násobok ± 0,1 SEM). Nižšia regulácia určitých proteínov a proteáz je spôsobená hodnotami