Výroba inzulínu
Cukrovka je civilizačnou chorobou číslo jeden. U typu I sú Langerhansove ostrovčeky zničené imunitným systémom. Tento typ sa vyskytuje pred 20. rokom života. U typu II (cukrovka so začiatkom v dospelosti), ktorá sa vyskytuje u väčšiny diabetikov, sú normálne alebo zvýšené hladiny inzulínu v krvi, ale zmeny v mieste, kde hormón účinkuje, znížia jeho funkčnosť.
Potreba inzulínu je extrémne veľká. Vďaka použitiu geneticky modifikovaných baktérií je dnes možné ich ľahšie pokryť ako kedysi. Pred použitím baktérií sa inzulín získaval z pankreasu ošípaných alebo hovädzieho dobytka. Diabetik používal na pokrytie svojej ročnej potreby pankreasy asi od 50 ošípaných.
Čo sa deje?
Vysvetľuje, ktoré vnútorné procesy v bunkách prebiehajú v beta bunkách a vedú k aktívnemu inzulínu.
Ako sa dá vyrobiť ľudský inzulín pomocou baktérií.
Produkcia inzulínu u ľudí
Inzulín je veľmi malý hormón tvorený dvoma reťazcami aminokyselín (reťazce A a B). A reťazec sa skladá z 21 aminokyselín, B reťazec z 30 aminokyselín.
Oba reťazce sa najskôr syntetizujú ako súčasť 110 AA reťazca. Táto dlhá forma je preproinzulín.
24 aminokyselín tohto prekurzora signalizuje endoplazmatické retikulum, aby ho absorbovalo. Táto signálna sekvencia sa počas záznamu rozdelí.
Zvyšných 86 aminokyselín tvorí proinzulín (reťazce A, B a C). A a B reťazce interagujú prostredníctvom disulfidových mostíkov (-S-S-).
C-reťazec (C-peptid) sa potom enzymaticky oddelí.
C-peptid zaisťuje priestorovo správne zarovnanie reťazcov A a B (tvorba disulfidových mostíkov); iba tak inzulín funguje.
Modifikácia proteínového prekurzora počas alebo po translácii je známa ako spracovanie proteínu.
Ako pripraviť ľudský inzulín s E. coli
Krok 1
Modifikovaná proinzulínová mRNA je izolovaná a syntetizovaná reverznou transkriptázou za vzniku hybridu RNA-DNA.
Krok 2
Pomocou DNA polymerázy je dokončený jeden reťazec DNA. CDNA je pripravená.
krok 3
Štartovací kodón je enzymaticky pripojený k inzulínovej cDNA (A.: TAC pre AUG → metionín, štartovací kodón), ako aj „lepivé konce“ (B.: lepivé konce) pripojené.
Výsledok
Hotová „DNA pre cestujúcich“ sa teda skladá z „lepivých koncov“, štartovacieho kodónu a génu proinzulínu pre reťazce B, C a A.
Rekombinovať - začleniť do vektora
Cudzia DNA získaná týmto spôsobom je teraz inkorporovaná do vektora pBR322. Vektor obsahuje gén pre beta-galaktozidázu a gén pre rezistenciu na ampicilín.
Krok 1
Pri štiepení pomocou Eco RI by sa cudzia DNA mala zabudovať do stredu génu pre galaktozidázu.
Krok 2
Vytvoria sa „lepivé“ konce, ktoré sa dopĺňajú s cudzou DNA.
krok 3
Interakcia „lepivých“ koncov vkladá cudziu DNA do plazmidu.
Krok 4
Medzery sú uzavreté DNA ligázami. Rekombinovaný plazmid je pripravený.
Dôležitosť operónu pre génovú expresiu
Inkorporáciou proinzulínového génu do génu pre galaktozidázu sa lac operón môže použiť na génovú expresiu. Galaktozidázový proteín zároveň chráni inzulínovú zložku pred vlastnými bunkovými enzýmami, proteázami, ktoré primárne okamžite rozkladajú menšie proteíny.
Moderné metódy využívajú gén tryptofánsyntázy na absorpciu proinzulínového génu, ktorý je riadený enzýmovou represiou. Typofánový operón obsahuje aj mechanizmus, ktorý zvyšuje génovú expresiu v prípade nedostatku tryptofánu, ktorý sa dá technicky dobre využiť.
Transformácia - výber - klonovanie
Plazmidy sa zavedú do E. coli transformáciou. Na výber sa používa rezistencia na ampicilín. Rekombinované baktérie sa množia vo fermentoroch.
Z bezpečnostných dôvodov boli inzulínové reťazce A a B exprimované osobitne v dvoch rôznych kmeňoch E. coli po dlhšiu dobu, aby sa vylúčila možnosť syntetizácie ľudského inzulínu baktériami. Takto vybavené baktérie by vyvolali cukrový šok, ak by sa dostali do našich čriev.
Expres - upraviť
Génová expresia sa uvedie do pohybu pridaním laktózy. Exprimuje sa gén beta-galaktozidázy so zabudovaným génom pre inzulín. Vytvorí sa fúzny proteín galaktozidáza a proinzulín.
Génový produkt sa izoluje z výživného média odstredením. Pomocou bromkyánu sa časť beta-galaktozidázy oddeľuje od proinzulínu tak, že sa v ňom zabuduje aminokyselina metionín.
Proinzulín je modifikovaný na inzulín pomocou enzýmu trypsín. Pretože baktérie nemajú potrebný enzým, musí sa pridať po vyčistení.
Produkcia interferónu baktériami
Dôležitosť expresie ľudských génov v hostiteľských bunkách (baktérie, kvasinky) je zrejmá aj z nasledujúceho príkladu interferónu. Ako aktívna zložka pri liečbe rakoviny alebo roztrúsenej sklerózy bola dostupná iba pre pár ľudí predtým, ako bola vyrobená s použitím geneticky modifikovaných baktérií. Dovtedy sa interferón získaval z krvných buniek. Na 400 mg interferónu bolo potrebných 50 000 litrov krvi. Dnes sa dá vyrobiť v akomkoľvek množstve pomocou rekombinovaných buniek E. coli.