Vytvorenie brušných adhézií v myšom protokole (preložené do nemčiny)

Úvod

Adhézie brucha sú formou jazvového tkaniva, ktoré sa tvorí v brušnej dutine ako reakcia na zápal, zvyčajne po operácii alebo intraabdominálnej infekcii. Zrasty sú hlavnou príčinou chronických bolestí brucha a neplodnosti a sú hlavnou príčinou obštrukcie tenkého čreva 1. Prítomnosť zrastov sťažuje vykonávanie druhej brušnej operácie a zvyšuje pravdepodobnosť komplikácií 2.

Napriek dlhoročnému výskumu zostávajú mechanizmy, ktoré sú základom tvorby adhézií, nedostatočne pochopené. Je známe, že počiatočné poškodenie peritoneálneho povrchu spôsobuje exsudáciu tekutiny bohatej na fibrín, ktorá potom vytvára zrazeninu, ktorá spája povrchy čreva a brušnej steny 3 dohromady. Neskôr fibroblasty a ďalšie bunky migrujú do adhézneho povrchu a vylučujú spojivové tkanivo 4. V priebehu mesiacov až rokov sa vyvinie adhézia krvných ciev a nervov 5.

Existuje niekoľko komerčných produktov, ktoré sú určené na zníženie tvorby adhézií po operácii brucha (napríklad Seprafilm). Všetky tieto produkty pôsobia ako mechanické bariéry a zastavujú tvorbu adhézie tým, že bránia fyzickému kontaktu medzi črevnými slučkami a brušnou stenou. 6,7. Napriek dôkazom z kontrolovanej štúdie, že chirurgická adhézna bariéra redukuje tvorbu adhézií 8, bolo mnoho chirurgov anekdoticky sklamaných z účinnosti produktov mechanickej bariéry.

V súčasnosti neexistujú žiadne antiadhézne terapie založené na liekoch, čo odráža skutočnosť, že presné procesy spojené s tvorbou adhézie nie sú dostatočne pochopené. Vývoj terapie, ktorá sa špecificky zameriava na bunkové alebo molekulárne látky podieľajúce sa na tvorbe adhézií, bude vyžadovať lepšie pochopenie udalostí, ktoré sa podieľajú na tvorbe adhézie. Niekoľko skupín identifikovalo molekulárne mechanizmy, ktoré môžu byť dôležité pre tvorbu adhézií 9-11. Zvieracie modely poskytujú vynikajúce prostredie pre tvorbu adhézií na štúdium. Bolo publikovaných veľa štúdií na niekoľkých zvieratách, najmä na potkanoch a myšiach 6,12-14, ktoré popisujú chirurgické vytvorenie zodpovednosti. Vzhľadom na naše skúsenosti s fibrózou u myší a so širokou dostupnosťou transgénnych myší a protilátok na báze myší v tejto štúdii sme si vybrali myš ako model pre štúdium adhézií. Tu uvádzame správu o technológii, ktorú sme vyvinuli na reprodukovateľné a spoľahlivé vytváranie adhézií v myši.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Nasledujúci protokol bol schválený Výborom pre ústavnú starostlivosť a použitie zvierat na Stanfordskej univerzite (IACUC) a spĺňa všetky inštitucionálne etické smernice týkajúce sa používania laboratórnych zvierat.

1. Tvorba adhézií

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Do siedmich dní po operácii by malo byť slepé črevo a pravdepodobne aj stúpajúce hrubé črevo, pečeň a slučky tenkého čreva prilepené k pravostrannej brušnej stene. (Obrázok 8) Oddelené tkanivá je možné zaliať a narezať, čo poskytuje vynikajúce histologické rezy. (11, 12)

Ak je postup vykonaný správne, 100% myší by malo mať výrazné zrasty za sedem dní. Úmrtnosť by mala byť nižšia ako 5%.

Obrázok 1: Príprava na operáciu a) Zviera bolo zaistené páskou a brucho bolo pripravené betadínom b) Betadín sa vymazal alkoholovým tampónom a vložila sa sterilná tkanina bol. om/files/ftp_upload/54450/54450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Ilustrácia 2. Rez Výrez z úrovne močového mechúra by mal siahať až k xyphoidu. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Ilustrácia 3:. Abrázia prílohy a) Prekrytie slepého čreva cez ľavý ukazovák špičkou smerujúcou doprava umožňuje stabilizáciu základne slepého čreva ľavým palcom b) Primeraná úroveň brúsnych listov. Cecum s drsným povrchom, ktorý je lesklý menší ako predtým, a s niekoľkými petechiálnymi bodmi krvácania. Obzvlášť opatrní by ste mali byť pri brúsení v blízkosti mezenterickej strany, pretože cievy tu krvácajú najrýchlejšie. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Ilustrácia 4:. Oter brušnej steny Vnútornosti sa zachytia a pozametaný peritoneálny povrch svalovej steny sa prebrúsi, až kým nebude drsný. Ciev videný tesne nad brúsnym papierom v brušnej stene je bežný, ale výrazne nekrváca. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

1 ">

Obrázok 5. The Umiestnenie postavy ôsmeho stehu Hodvábny steh číslo 8 umiestnený do svalovej steny pred uviazaním. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázku.

Obrázok 6:. The Aplikácia sily ľahká vrstva škrobu sa posype cez brušnú stenu a črevá. Vo svalovej stene sú viditeľné dva stehy číslo osem. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

7.: Rez pre druhú operáciu a) Rez sa začína iba na ľavej strane pôvodného rezu b) Nový rez by sa mal rozširovať od úrovne močového mechúra po hrudný kôš. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obr . 8.: Zodpovednosť Slučky tenkého čreva (SB) sú prilepené k pravej bočnej stene a k sebe navzájom. Je vidieť pôvodný stredový rez, ktorý je teraz zahojený (Inc). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

trong> Obrázok 9: Výrez adhéznej tkaniva. a) a b) „Ostrov“ kože a brušnej steny fúzovaný s podložným črevom sa uvoľní prerezaním v úplnom kruhu okolo priľnavej oblasti. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Ilustrácia 10:. Vzorka Rez cez črevo bude mať za následok sendvič tkaniva s vnútornosťami na jednej strane a) a pokožka na druhej strane b). Ak sa má vzorka použiť na histológiu, mali by sa viditeľné kúsky stehu odstrániť. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">

Obr . 11: histológia Sekcia hematoxylínu a eozínu (H&E) zafarbená lepidlom sedem dní po chirurgickom zákroku, ktorá ukazuje kožu a brušnú stenu (dole) pripevnené cez rozhranie lepidla k slepému črevu (hore). V tomto skorom časovom okamihu je pravdepodobné, že príloha k brušnej stene je primárne priľnutá k fibrínu a iným molekulám, a ešte sa nevytvorilo významné tkanivo jazvy. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 12: Imunofluorescencia - Zobrazovanie Úsek adhézie sedem dní po chirurgickom zákroku bol imunofluorescenčne pre a-hladké svalstvo ac farebný.Cín, ktorý vykazuje skutočné sfarbenie vlasových folikulov kože (vľavo) a stenu svalov slepého čreva (v strede) a nešpecifické sfarbenie povrchu luminálneho povrchu slepého čreva (vpravo). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Kritickými krokmi v tomto postupe sú: dôkladné prebrúsenie slepého čreva bez toho, aby došlo k perforácii, zavedenie stehov do brušnej steny a použitie správnej sily. Brúsny papier nanášajte iba na slepé črevo alebo na malú konkrétnu časť čreva. Široké použitie šmirgľového papiera na veľké množstvo tenkého čreva má tendenciu spôsobovať značný ileus. Dajte pozor, aby ste slepé črevo obrúsili dostatočnou silou, aby bol povrch drsný, ale nie natoľko, aby praskla stena. Nájsť túto rovnováhu môže chvíľu trvať. Uchopte črevo opatrne a pri manipulácii s črevom sa vyhýbajte ostrým alebo zubným kliešťom. Je ľahké náhodne spôsobiť krvácanie uchopením klieští tenkého čreva alebo príliš silným potiahnutím za črevo.

Ak sa v stene slepého čreva objaví trhlina, postup by sa mal zastaviť a zviera by malo byť usmrtené. Z našich skúseností vyplýva, že slzná váčka má za následok smrť zvieraťa po niekoľkých dňoch, aj keď je slza dobre opravená. Navyše prasknutie steny slepého čreva spôsobí rozliatie stolice, čo bude mať nepredvídateľným spôsobom vplyv na zápalovú reakciu.

Po ukončení procedúry musí byť hemostáza úplná. Niektoré krvácajúce cievy sa znovu otvoria a začnú po ukončení krvácania. Ak máte pochybnosti, dajte okolo bodu krvácania vstrebateľnú monofilovú figúrku stehu číslo osem. Tento typ nite je vhodnejší ako hodvábny alebo pletený vstrebateľný steh, pretože sa dá vytiahnuť s minimálnym odporom, hoci je to tkanina. Zistili sme však, že hodváb alebo spletený vstrebateľný steh je najúčinnejší na vyvolanie zrastov v brušnej bočnej stene ako monofil, ktorý je menej zápalový.

Aplikácia škrobu na konci procedúry pomôže zvýšiť tvorbu adhézií, ale zistili sme, že nadmerné množstvo škrobu spôsobí zápalovú reakciu, ktorá spôsobí smrť. Škrob treba mierne posypať. Nemalo by to byť toľko, aby tvorilo pevnú vrstvu.

Ako prvý postup, ktorý sa treba naučiť, je bežné stratiť viac myší. Podľa našich skúseností sú najčastejšou príčinou smrti dehydratácia v dôsledku ileu spôsobená nadmerným obrusovaním čreva a sepsa v dôsledku perforácie čreva. Smrť spôsobená krvácaním môže nastať, ak sa na konci operácie nedosiahne úplná hemostáza.

Ak je tvorba zrastov nedostatočná, zvážte agresívne obrúsenie slepého čreva a pravej bočnej steny, ktoré zanechá väčšiu pevnosť, alebo položte viac stehov na bočnú stenu. Podľa našich skúseností vedie čakanie menej ako týždeň pred bruškom k opätovnému otvoreniu menej ako dostatočnej formácie adhézie. Na druhej strane, ak je úmrtnosť myší po operácii vysoká, zvážte použitie menej agresívneho obrusu slepého čreva, presnejšie na kontrolu hemostázy, a nanesenie menšieho množstva škrobu na druhú stranu. Je tiež dôležité starostlivo sledovať dychovú frekvenciu myši počas operácie. Ak chirurg získa skúsenosti s týmto zákrokom, úmrtnosť by mala byť menej ako 10%.

Táto technika bola vyvinutá na primárne vytváranie adhézií medzi slepým črevom a pravou bočnou stenou brucha. Často sa tiež tvoria adhézie medzi tenkým črevom, pečeňou a stredným rezom. Použitie tejto techniky zvyčajne nespôsobí zrasty na ľavej strane brucha. Obmedzením tejto techniky je, že je pravdepodobnejšie, že sa tvoria zrasty medzi črevom a brušnou stenou, ako zrasty medzi črevnými kľučkami. Okrem toho nie je pravdepodobné, že výsledkom bude tkanivo plné lepidla v úplne zmrznutom žalúdku, čo sa často vyskytuje u ľudí, ktorí podstúpili viacnásobné operácie.

Obsah "> Pretože táto technika neustále spôsobuje tvorbu adhézneho tkaniva medzi slepým črevom a bočnou stenou, domnievame sa, že je ideálne navrhnutý pri testovacích zásahoch na zníženie tvorby adhézie. Túto techniku je možné použiť aj na preskúmanie molekulárnych dráh a typov buniek. sa podieľajú na tvorbe adhézie. Adhézne tkanivo je ľahko vyrezané a pripravené na histológiu, čím poskytuje vynikajúce histologické obrazy (Obrázky 11, 12) môže byť.

Niektorí vedci môžu chcieť model, v ktorom sa adhézie tvoria menej ako 100% času. Vynechanie aplikácie škrobu zníži mieru adhézie na približne 80%. Zníženie počtu hodvábnych nití umiestnených v pravej brušnej stene ešte viac zníži mieru adhézie.

Podľa našich skúseností je siedmy deň po operácii prvým bodom v čase, keď je črevo neustále pripevnené k brušnej stene. Relevantnejšie však môžu byť aj iné časy, v závislosti od zamerania projektu. Napríklad vedci, ktorí sa zaujímajú o migráciu neutrofilov a makrofágov do zadržiavacej miestnosti, si môžu želať, aby boli schopní odobrať tkanivo počas prvých piatich dní po operácii. Na druhej strane k ukladaniu kolagénu fibroblastmi dochádza niekoľko týždňov po počiatočnom poranení, a preto má zmysel skúmať tkanivo občas rozložené niekoľko týždňov po operácii.

Chirurgické zväčšovacie okuliare sú pri vykonávaní tohto zákroku veľmi užitočné na zväčšenie operačného poľa. Môže sa tiež použiť chirurgický mikroskop, ale schopnosť chirurga kontrolovať chirurgické pole z rôznych uhlov je obmedzená. Procedúru je tiež možné uskutočňovať bez zväčšenia.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Zverejnenie

Autori tvrdia, že nemajú finančné záujmy.

Poďakovanie

Program CDM podporilo rezidentné výskumné štipendium American College of Surgeons (ACS). Spoločnosť MSH podporil Grant pre klinické vzdelávanie kolegov z Kalifornského inštitútu pre regeneratívnu medicínu (CIRM) TG2-01159. MSH, HPL a MTL boli podporené cenou Grantovej ceny American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxilofacial Surgeons Foundation (MSF). Spoločnosť HPL bola podporená grantom NIH R01 GM087609 a darom Ingrid Lai a Billa Shu na počesť Anthonyho Shu. HPL a MTL podporili Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine a Oak Foundation. Spoločnosť MTL bola podporená z fondu Gunn/Olivier Fund.