Z lekárskej univerzitnej kliniky

1 Z kliniky internej medicíny Lekárskej univerzity ΙΙΙ na Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Úloha TRAF2 a TRAF6 pri ateroskleróze I N A U G U R Á L - D I S S E R T A T I O N pre získanie titulu lekára na lekárskej fakulte Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br., Ktorý v roku 2010 predstavil Peter Stachon Göppingen

lekárskej

2 Dekan: Prof. Dr. DR. h.c. mult. Hubert Erich Blum 1. recenzent: PD Dr. Andreas Zirlik 2. recenzent: PD Dr. Michael Hoffmann Rok PhD: 2011

4 Obsah TRAF2 a TRAF6 pri ateroskleróze Genotypizácia myší: izolácia DNA Genotypizácia myší: polymerázová reťazová reakcia (PCR) Transplantácia fetálnych pečeňových buniek u myší Proces transplantácie fetálnych pečeňových buniek Generovanie darcovských kmeňových buniek Genotypizácia darcov: Qiagen-Kit Kmeňové bunky Myeloablatívne ožarovanie recipientných myší a transplantácia Transplantácia fetálnych pečeňových kmeňových buniek u myší CD45.1 Štúdia kŕmenia Retroorbitálny odber krvi pred diétou Diéta s vysokými dávkami cholesterolu Vyhodnotenie aterosklerózy Príprava myší po 18-týždňovej diéte s vysokými dávkami cholesterolu Výroba preparátov z brušnej aorty Výroba histologických preparátov Farbenie Olej-červená-O Farbenie na farbenie obsahu tuku v arteriálnej stene Imunohistochemické farbenie MAC-3 na makrofágy v stene artérie Imunohistochemické farbenie pomocných buniek CD4 + T Imunohistochemické farbenie hladkých svalov K Kolagén: Sfarbenie červenou farbou Picrosirius Vyhodnotenie Fotografovanie rezov Vyhodnotenie koreňa aorty Vyhodnotenie aortálnych oblúkov a brušnej aorty. 42

8 Úvod TRAF2 a TRAF6 pri ateroskleróze Obrázok 1: V Európe sú najčastejšou príčinou úmrtia kardiovaskulárne choroby. Najčastejšie sú príčinou chorôb kardiovaskulárneho systému muži (hore) aj ženy (dole). Väčšina z týchto chorôb je patofyziologicky založená na ateroskleróze. Zdroj:

52 Výsledky TRAF2 a TRAF6 pri ateroskleróze Po štvortýždňovej rekonštitučnej fáze bola myšiam odobratá krv a tá bola vyhodnotená pomocou FACS pre rekonštitúciu CD45.1 dvojitým farbením s CD45.1-APC a CD45.2-PE. Tento experiment ukazuje úspešnú rekonštitúciu: 95,2% a 95,0% krviniek bolo nahradených kmeňovými bunkami získanými z pečene plodu. Ďalej sa ukázalo, že CD19-pozitívne B lymfocyty, CD3-pozitívne T lymfocyty a CD11b-pozitívne leukocyty, ako sú monocyty, makrofágy, granulocyty a prirodzené zabíjačské bunky, nesú povrchový marker CD45.1 po transplantácii fetálnych pečeňových buniek. Ak niekto podrobnejšie analyzuje tieto podskupiny, zistí, že CD11b- a CD19-pozitívne bunky boli nahradené darcovskými bunkami na viac ako 99%. Iba v skupine T buniek sú asi 4% prijímajúcich buniek, čo sú najpravdepodobnejšie T pamäťové bunky (obr.7).

53 Výsledky TRAF2 a TRAF6 pri ateroskleróze Obr. 7: Úspešná rekonštitúcia buniek periférnej krvi transplantáciou fetálnych pečeňových buniek Myši LDLR -/- (CD45.2 pozitívne/cd45.1 negatívne, A) boli ožarované myeloablatívne (2x450 cGy) a fetálnymi pečeňovými bunkami z dní staré plody (CD45.2 negatívne, CD45.1 pozitívne, B) sa rekonštituovali. O 4 týždne neskôr bola z myší odobratá krv a bola vykonaná FACS analýza transplantovaných zvierat na povrchové markery CD45.1 a CD45.2 (napríklad C.

59 výsledkov TRAF2 +/+/LDLR -/-: mm2, 0,53 ± 0,18 +/+ kontrolná skupina (TRAF2/LDLR tiež TRAF2- kmeňové bunky heterozygotné rekonštituované TRAF2 a TRAF6 pri ateroskleróze -/- N = 13, p = +/+ 0,56) v porovnaní s -/- až 2 v TRAF2/LDLR: 0,41 ± 0,08 mm, N = 16). Príjemcovia, ktorí mali TRAF2-deficitnú podobnú veľkosť aterosklerotických lézií (TRAF2 -/-/LDLR -/- v TRAF2 +/-/LDLR -/-: 0,48 ± 0,01 mm2, N = 17, p = 0,60, obr. 12). Okrem veľkosti aterosklerotickej lézie je veľmi zaujímavé aj jej zloženie, pretože ovplyvňuje stabilitu plaku. Ak sa zvýši podiel lipidov v plaku, je to spojené so zvýšeným výskytom prasknutia plaku u ľudí. Deficit TRAF2 však nemá žiadny vplyv na obsah lipidov v aterosklerotických léziách (obr. 12). B 0,08 p = 0, p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/v TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/v TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/v TRAF2 +/-/LDLR -/- Olejovo-červené-O pozitívne farbenie/veľkosť lézie celej steny cievy (mm 2) A 0,15 p = 0,54 p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/v TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/v TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/v TRAF2 +/-/LDLR -/- C TRAF2 +/+/LDLR-/v TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/v TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/v TRAF2 +/-/LDLR -/- Obr. 12: Nedostatok TRAF2 nemá žiadny vplyv na Veľkosť stále ovplyvňuje obsah lipidov v aterosklerotických léziách

Výsledky TRAF2 a TRAF6 pri ateroskleróze TRAF6 nemení zloženie aterosklerotických lézií Ďalej bola testovaná hypotéza, či má TRAF6 vplyv na zloženie aterosklerotických lézií. U ľudí to má následky na stabilitu a tým aj na náchylnosť k prasknutiu aterosklerotickej lézie. Preto sa podľa stravy pripravili histologické rezy, ktoré sa farbili na makrofágy (obr. 17A), na lipidy (obr. 17B), bunky hladkého svalstva (obr. 17C), kolagén (obr. 17D) a T bunky (obr. 17E) boli. Ukazuje sa, že nedostatok TRAF6 nemá žiadny vplyv na zloženie aterosklerotickej lézie, pretože vo všetkých vykonaných farbeniach sa nezistil signifikantný rozdiel medzi týmito tromi skupinami.

67 Výsledky TRAF2 a TRAF6 pri ateroskleróze A Mac-3 pozitívna oblasť (%) p = 0,23 p = 0,52 B olejovo červená-O pozitívna oblasť (%) p = 0,58 p = 0,98 C pozitívna oblasť na α-aktín (%) p = 0,95 p = 0,16 D mikroskopická redpositívna plocha (%) p = 0,36 p = 0,66 E 100 buniek CD4 +/stena cievy p = 0,74 p = 0,21 TRAF6 +/+/LDLR -/- v TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- v TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- v TRAF6 +/-/LDLR -/- 0 Obr. 17: Nedostatok TRAF6 mení plak Zloženie, ktoré nebolo myeloablatívne ožiarené, dostali TRAF6 +/+/LDLR -/- myši buď TRAF6 +/+/LDLR -/- (biele pruhy, N = 21) alebo TRAF6 -/-/LDLR -/- kmeňové bunky (šrafované pruhy, N = 21). Myši TRAF6 +/-/LDLR -/- boli rekonštituované s TRAF6 -/-/LDLR -/- kmeňovými bunkami (čierne pruhy, N = 22). Potom dostali všetky skupiny 18 týždňov stravu bohatú na cholesterol, na konci ktorej bolo pomocou imunohistochemického farbenia kvantifikované zloženie aterosklerotických lézií v oblasti koreňov aorty. Výsledky pre makrofágy (A), lipidy (B), bunky hladkého svalstva (C), kolagén (D) a T bunky (E) sú zhromaždené a sú uvedené ako priemer ± SEM.

68 Výsledky TRAF2 a TRAF6 pri ateroskleróze TRAF6 nemá žiadny vplyv na aterogenézu v zostupnej aorte a v aortálnom oblúku. Pretože ateroskleróza sa môže vyvíjať odlišne v rôznych bodoch cievneho systému, bola po zafarbení analyzovaná zostupná aorta až po bifurkáciu v tvári. lipidov pomocou Oil-Red-O. Ako sa očakávalo, v brušnej aorte neboli žiadne rozdiely medzi zvieratami, ktoré mali deficit TRAF6 (21,0 ± 2,9%, N = 8, p = 0,90) alebo kompetentný TRAF6 (20,5 ± 2, 6%, N = 8) boli kmeňové bunky transplantované. Príjemcovia TRAF6 +/-/LDLR -/-, ktorí dostávali hematopoetické kmeňové bunky s nedostatkom TRAF6 (25,2 ± 2,6%, N = 10, p = 0,23), mali tiež podobnú distribúciu lipidov ako kontrolná skupina (obr. 18A a B). V histologicky analyzovaných aortálnych oblúkoch majú zvieratá, ktoré boli transplantované kmeňovými bunkami s deficitom TRAF6, tiež podobné veľkosti plakov v kontrolnej skupine (TRAF6 -/-/LDLR -/- v TRAF6 +/+/LDLR -/-: 0,012 ± 0,003 mm2)., N = 18, p = 0,85, TRAF6 -/-/LDLR -/- v TRAF6 +/-/LDLR -/- (0,020 ± 0,006 mm2, N = 16, p = 0,85, TRAF6 +/+/LDLR -/- v TRAF6 +/+/LDLR -/-: 0,013 ± 0,003 mm 2, N = 20, obr. 18 C a D).

69 Výsledky TRAF2 a TRAF6 pri ateroskleróze Obrázok 18: Deficit TRAF6 mení distribúciu lipidov v brušnej aorte a veľkosť aterosklerotických lézií v aortálnom oblúku, myeloablatívne neožiarené TRAF6 +/+/LDLR -/- myši dostávali buď TRAF6 +/+/LDLR -/- (biele pruhy, N = 8) alebo TRAF6 -/-/LDLR -/- kmeňové bunky (šrafované pruhy, N = 8). Myši TRAF6 +/-/LDLR -/- boli rekonštituované s TRAF6 -/-/LDLR -/- kmeňovými bunkami (čierne pruhy, N = 10). Potom všetky skupiny dostávali stravu s vysokým obsahom cholesterolu po dobu 18 týždňov, na konci ktorej sa analyzovala ateroskleróza v brušnej aorte po farbení olejom Red-o proti lipidom na tvári. Súhrnné výsledky sú uvedené ako olej-červená-O na celkovú plochu ± SEM (A); reprezentatívne aorty sa fotografujú bez zväčšenia v dolnom rade (B). Po diéte boli urobené histologické rezy aortálnych oblúkov a zafarbené pomocou Oil-Red-O. Zhromaždené veľkosti aterosklerotických lézií ± SEM sú uvedené v hornom riadku (C), nižšie sú reprezentatívne histologické rezy zafarbené olejom-červenou-O v štvornásobnom zväčšení (D).