Z pôrodníckej kliniky

1 Z pôrodníckej kliniky Lekárskej fakulty Charité Universitätsmedizin v Berlíne DISZERTÁCIA Th 1 -cytokíny a protrombináza fgl2 v normálnom a patologickom tehotenstve Predložené na Lekársku fakultu Charité Humboldtovej univerzity za účelom získania akademického titulu Doctor medicinae (Dr. med.) Berlín Maike Knackstedt z Berlína

kliniky

2 dekani: Prof. Dr. med. J.-W. Dudenhausen prof. Dr. med. Recenzent Matin Paul: 1. Prof. Dr. med. J.-W. Dudenhausen 2. Prof. Dr. med. habil. H. Donat 3. Prof. Dr. med. G. Schönfelder Dátum doktorátu: 24. septembra 2004

3 Obsah 3 Obsah Zoznam skratiek 5 Ciele 6 1 Úvod Základy implantácie embrya Začiatok tehotenstva Transplantačný model Patologická implantácia Imunologické základy gravidity Paradigma Th 1/Th 2 Úloha cytokínov Th 1 v tehotenstve Dôsledky imunologickej nerovnováhy v gravidite Aktivácia koagulačného systému Úloha apoptózy v gravidite Aspekty spontánneho potratu Imunologické princípy spontánneho potratu Dva potratové modely u myší CBA/J: stres verzus IL imunologické aspekty preeklampsie Otázka 21 2 Materiál a metódy Testované zvieratá Kolektív pacientov Experimentálne nastavenie experimentov na zvieratách Miera potratov v percentách Príprava tkaniva Celková extrakcia RNA Spracovanie vzoriek RNA DNAse Reverzná transkripcia Kvalitatívna PCR Agarózová elektroforéza Kvantitatívna PCR analýza údajov Taq-Man Príprava plazmidovej DNA v v malom meradle (mini príprava) linearizácia plazmidu cDNA syntéza 35 S-značenej RNA sondy in situ hybridizácia imunohistochémia TUNEL farbenie Giemsa farbenie štatistická analýza dát 41

4 Obsah 4 3 Výsledky Zvýšenie potratovosti stresom a injekciou IL-12 p Vplyv stresu na expresiu mrna abortogénnych cytokínov Zvýšenie TNF-α mrna po vystavení stresu Expresia IFN-y po aplikácii stresu Die Vplyv mrna expresie IL-12 stresom Pomer potratovosti k kvantitatívnemu množstvu cytokínov Cytokínový profil po injekcii IL Porovnanie expresie fgl2 mrna pri strese a po injekcii IL Indukcia apoptózy stresom a IL -12 v myšom modeli Expresia TNF-α v prvom trimestri a treťom trimestri Expresia proteínu fgl2 mrna a fgl2 v ľudskom placentárnom tkanive Prvý trimester Tretí trimester Apoptóza v preeklampsii a spontánnom potrate 59 4 Diskusia 61 5 Zhrnutie 72 6 Zoznam publikácií 74 7 Príloha 91

5 Zoznam skratiek 5 Zoznam skratiek// Zvýšenie/Zníženie/konštantná ASA Kyselina acetylsalicylová CD Klaster diferenciácie DNA Kyselina deoxyribonukleová (A = kyselina) COX Cyklooxygenáza EGF Epidermálny rastový faktor fgl2 Fibrinogén podobný proteín 2 HLA Ľudský leukocyt-antigén Transferáza IDO Indolamín-2,3-dioxygenáza IFN-y Interferón-gama IL Interleukín IRF Interferón-regulačný faktor LIF Leucemia-Inhibičný faktor LPS Lipopolysacharid MHC Hlavný-Histokompatibilita-Komplex MHV3 Myšia hepatitída-Virus MIP-Makrofág-Zápal mrna (messenger) ribonukleová kyselina (A = kyselina) NK bunky/uNK bunky Prírodné zabíjačské bunky/maternicové NK bunky NO oxid dusnatý NOS (inos) syntáza oxidu dusnatého (indukovateľná syntáza oxidu dusnatého) OX orexín = CD 200 PAI inhibítor aktivátora plazminogénu PCR polymerázová reťazová reakcia PE preeklampsia PMNL polymorfonukleárne leukocyty RT reverzná transkriptáza TGF transformujúci rastový faktor Th T pomocná bunka TNF-a tumor nekrotizujúci faktor-alfa VEGF vaskulárny endoteliálny rastový faktor

6 Ciele 6 Ciele Cieľom tejto práce je 1 na myšom modeli s párovacou kombináciou žien CBA/J a mužov DBA/2J rozdiely v profile cytokínov maternice a úlohe proteínu fibrinogénu podobného protrombináze 2 (skrátene fgl2) v strese vyvolanom a potraty vyvolané zápalom. 2 charakterizovať cytokínový profil v súvislosti s možnou aktiváciou koagulačného systému prostredníctvom fgl2 ako protrombinázy v decidálnom tkanive pacientov s normálnym tehotenstvom a pacientov v prvom trimestri s potratom. 3 popisuje expresiu Th1 cytokínov a fgl2 v placentárnom tkanive u pacientok s nekomplikovaným priebehom tehotenstva a pacientok s preeklampsiou v treťom trimestri.

22 Úvod 22 Tehotenské komplikácie Skúmajú sa spontánne potraty a preeklampsia a súvislosť s imunologickou nerovnováhou.

25 Materiál a metódy 25 Implantačná resorpcia Obrázok 3: Reprezentácia jedného z bočných rohov myšej maternice v tvare písmena V Zobrazujú sa dve implantácie () a dve resorpcie () do myšej maternice v deň 13,5 gestačného tehotenstva, preto ležia v bočnej rohovine maternice, ktorá je uvedená vyššie. miera potratovosti 50%. 2.5 Príprava tkaniva Pre molekulárne biologické vyšetrenia sa pripravilo 100 mg maternicového tkaniva z miest úspešných implantácií a opatrne sa premylo sterilným PBS (pH = 7,4) a potom sa okamžite zmrazilo pomocou kvapalného dusíka a skladovalo sa pri 80 ° C, kým sa izolovala RNA. Z absorpčnej strany neboli odobraté žiadne vzorky tkaniva, pretože tkanivo sa už hemoragicky rozložilo a nekrotické a skúšobné testy preukázali, že toto tkanivo nie je vhodné na diagnostiku cytokínov. 2.6 Celková extrakcia RNA Materiál: Trizol Chloroform Etanol (100%, 75%) Agarózový gél 1,5% Ethiduimbromid (10 mg/ml) Despergierstation Centrifuge (5415C) Gibco BRL, Karlsruhe, D Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Biozym, Oldendorf, D Gibco BRL, Karlsruhe, DT 8.10, IKA Labortechnik Eppendorf, Hamburg, D

31 Materiál a metódy 31 (hypoxantínfosforibozyltransferáza) ako referenčný gén. Všetky sondy boli skontrolované na svoju špecificitu pre cdna, to znamená, že genómová DNA nebola amplifikovaná. Sekvencie primérov: Murines HPRT: Ex 7,8: 5 -gttggatacaggccagactttgt Reverse: 5 -CACAggACTAgAACACCTgC Murines IFN-γ: Forward: 5 -CagCAACAACATAAgCgTCAT Reverse: 5 -CTCCTTTTCCgCTTCCTgAgtgerse TNGca- Murines fgl2: Forward: 5 -CAACAgTTTggATggCAAgTg Reverse: 5 -CTTTgTATATTAgATgAACCgg Murines IL-12 p40: Forward: 5 -TTCAgTgTCCTgCCAggAgg Backward: 5 -CgggTCTCCGGTTTGATgATg HPRT: 5-6FAM-TTgCAgATTCAACTTgCgCTCA XT CTT p PCR teplota: 60 C alebo 63 C myši Murphy IFN-γ: 5-6FAM-TTCCggCAACAgCTggTggACCAC XT p teplota PCR: 60 C Murines TNF-α: 5-6FAM-gTAgACAAggT Teplota PCR: 63 C Myši fgl2: 5-6 FAM-gTgTCCCAgCCAAgAACACA XT gca p Teplota PCR: 63 C

Materiál a metódy Štatistická analýza údajov Na semikvantitatívne vyhodnotenie imunohistochémie sa použila ordinálna stupnica s hodnotením +/++/+++. Na štatistickú analýzu týchto údajov sa ako neparametrický test pre nezávislé vzorky použil Mann-Whitneyov U test. Údaje sú graficky zobrazené v škatuľkových grafoch. PCR v reálnom čase sa hodnotila, ako je opísané vyššie. Po približnom teste normálneho rozdelenia boli dáta vyhodnotené Studentovým T testom a prezentované v stĺpcových grafoch so štandardnou odchýlkou.

47 Výsledky 47 Rovnako IL-12 p40 (r = 0,24) a IL-12 p35 (r = -0,29) nevykazujú nijakú súvislosť s podielom resorpcií (obrázok 11 a obrázok 12)% potratov r = IL-12 p40mrna Obrázok 11: Korelácia medzi percentom potratov a množstvom IL-12 vyjadrená p40 mrna Medzi množstvom IL-12 p40 a percentom resorpcií% potratov nie je korelácia r = IL-12 p35 mrna Obrázok 12: Vzťah medzi mierou potratovosti v percentách a množstvom exprimovaného IL-12 p35 mrna Medzi množstvom IL-12 p35 a percentom resorpcií neexistuje korelácia.

48 Výsledky Cytokínový profil po injekcii IL-12 Otázkou je, či IL-12 ako aktívny cytokín T-buniek môže indukovať imunitnú reakciu Th1 u myši, čo potom vedie k zvýšeniu potratovosti. Po injekcii IL-12 ukázali merania 9,5-násobné zvýšenie IFN-y mrna (obrázok 13). Je zaujímavé, že injikovaný rekombinantný IL-12 mal tiež vplyv na expresiu TNF-a: Po injekcii sa expresia TNF-a mrna zvýšila 8,8-násobne (obrázok 13). Po stimulácii IL-12 došlo následne k porovnateľnej konštelácii cytokínov so súčasnou prítomnosťou vysokých množstiev TNF-a a IFN-y, ako pri súčasnej injekcii oboch cytokínov: 108-násobok mrna n = 5 n = 7 n = 7 kontrola, žiadna injekcia IFN-y mrna po injekcii IL-12 TNF-a mrna po injekcii IL-12 Obrázok 13: Cytokínová regulácia po injekcii IL-12 p70 Významné zvýšenie TNF-a a IFN-y po Injekcia rekombinantného IL-12 p Porovnanie expresie fgl2 mrna počas stresu a po injekcii IL-12. In situ hybridizácia ukazuje histologicky lokalizáciu fgl2 mrna v maternici myší CBA/J v deň 13,5 dňa Gravidita (obrázok 14).

50 Výsledky 50 Zistilo sa však, že množstvo TNF-a mrna má negatívny vzťah s množstvom fgl2 mrna (obrázok 16). Medzi fgl2 mrna a IFN-y mrna nebol štatisticky jasný vzťah (obrázok 17). 9,5 9,0 TNF-α mrna 8,5 8,0 7,5 7,0 r = Fgl2 mrna 6 8 Obrázok 16: Vzťah medzi množstvom TNF-α a množstvom fgl2 mrna Neukazuje žiadne významné Korelácia medzi množstvom TNF-α a množstvom fgl2 mrna, negatívny vzťah medzi týmito dvoma parametrami možno považovať za tendenciu. 14 IFN- γ mrna r = 0, Fgl2 mrna 6 8 Obrázok 17: Vzťah medzi množstvom IFN-γ mrna a vyjadreným množstvom fgl2 mrna Medzi množstvom IFN-γ a množstvom fgl2 mrna nie je žiadna korelácia.

53 Výsledky 53 AB Obrázok 20: Imunohistochémia pre TNF-a v placente 3. trimestra s normálnym tehotenstvom (A) ukazuje IgG kontrolu a (B) ukazuje farbenie na TNF-a proteín. A B Trophoblastová nádoba Obrázok 21: Imunohistochémia pre TNF-a v 3. trimestri placenty pacientov s preeklampsiou (A) ukazuje IgG kontrolu a (B) ukazuje farbenie na TNF-a proteín. Špecifická analýza buniek pozitívnych na TNF-a v preeklampsii je uvedená v tabuľke 1: endoteliálny trofoblast placentárnych makrofágov PE (n = 10) +/++ + +/++ (n = 12) + +/- +/++ Tabuľka 1: Imunohistochémia pre TNF-α v 3. trimestri placenty u normálneho tehotenstva a u pacientov s preeklampsiou Zvýšená expresia proteínu TNF-α v endotelových bunkách a trofoblastoch v preeklampsii (PE) v porovnaní s normálnym tehotenstvom. Žiadny rozdiel v expresii proteínu TNF-a v bunkách trofoblastov a placentárnych makrofágoch.

54 Výsledky Expresia proteínu fgl2 mrna a fgl2 v ľudskom placentárnom tkanive Prvý trimester Obrázok 22 zobrazuje údaje získané pomocou hybridizácie in situ. A B Obrázok 22: Hybridizácia in situ pre fgl2 mrna villus 1. trimestra (A) ukazuje zmyslovú kontrolu a (B) ukazuje antisense farbenie pre fgl2 mrna. Zobrazujú sa placentárne klky s dvojbunkovou trofoblastovou vrstvou pozostávajúcou zo syncytiotrofoblastov a cytotrofoblastov, ktoré sú charakteristické pre prvý trimester. Hybridizácia in situ sa uskutočňovala s použitím sondy fgl2 mrna značenej35S. V obidvoch znázornených klkoch je typické čierne značenie vrstvy trofoblastu vo vzorke antisense, pričom vzorka mrna je zrkadlovým obrazom sekvencie fgl2 mrna. V negatívnej kontrole sense snímka, v ktorej je vzorka identická so sekvenciou fgl2-mrna, nie je pozitívny signál. Trofoblast tiež vykazuje pozitívne signály (hnedé) pre proteín fgl2 v imunohistochémii (obrázok 21).

55 Výsledky 55 A B Obrázok 23: Imunohistochémia pre fgl2 v placente v 1. trimestri s normálnym tehotenstvom (A) ukazuje kontrolu IgG a (B) ukazuje vyfarbenie proteínu fgl2 a reprezentatívnej časti cievy. Tieto výsledky po prvýkrát ukazujú, že proteíny fgl2 mrna a fgl2 sú exprimované v ľudských trofoblastových bunkách, najmä ak došlo k spontánnemu potratu. Počet fgl2-pozitívnych ciev v celkovom počte ciev sa zvýšil, ak došlo k spontánnemu potratu (obrázok 24). Fgl2 pozitívne cievy/celkový počet ciev 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 n = 6 * n =% medián 25% kontrola Spontánny potrat Obrázok 24: expresia proteínu fgl2 v endotelových bunkách Cievy v prvom trimestri Semikvantitatívna analýza imunohistochémie pre fgl2 na cievach v decidua basalis kontroly a spontánneho potratu.

Výsledky 56 Semikvantitatívne vyhodnotenie expresie fgl2 zottických trofoblastov ukazuje, že pacientky s potratom majú vyššiu expresiu fgl2 ako pacientky s elektívnym ukončením tehotenstva (obrázok 25). Intenzita vyfarbenia fgl2 pozitívnych zottických trofoblastov 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 n = 6 * n = 9 75% medián 25% kontrola spontánneho potratu Obrázok 25: expresia proteínu fgl2 v trofoblastoch prvého trimestra Semikvantitatívna analýza imunohistochémie pre fgl2 na trofoblastových bunkách decidua basalis pri kontrole a spontánnych potratoch Trofoblasty ciev AB Obrázok 26: Imunohistochémia pre fgl2 v placente 1. trimestra u potratových pacientov (A) ukazuje kontrolu IgG a (B) zobrazuje farbenie na proteín fgl2 a reprezentatívny rez nádobou.

58 Výsledky 58 Nasledujúci obrázok 28 zobrazuje zrelé klky placenty v treťom trimestri s normálnym priebehom tehotenstva. Trofoblastové bunky príležitostne exprimujú proteín fgl2 (obrázok 26 B). Obrázok 29 zobrazuje placentu pacienta s preeklampsiou, pričom trofoblasty exprimujú proteín fgl2 homogénnejšie. A cievy A Obrázok 28: Imunohistochémia pre fgl2 v placente 3. trimestra s normálnym tehotenstvom (A) ukazuje IgG kontrolu a (B) ukazuje farbenie na fgl2 proteín. A B Obrázok 29: Imunohistochémia pre fgl2 v placente 3. trimestra pacientov s preeklampsiou (A) ukazuje IgG kontrolu a (B) ukazuje farbenie na fgl2 proteín. V súlade s týmto pozorovaním bolo možné pozorovať pôsobivé usadeniny fibrínu vo vzorkách placenty od pacientov s preeklampsiou v porovnaní so vzorkami placenty v nekomplikovanom tehotenstve.

59 Výsledky Apoptóza pri preeklampsii a spontánnom potrate Th1 cytokíny, najmä TNF-α, sú schopné spustiť programovanú bunkovú smrť vo forme apoptózy. Vyšetrenie apoptotických signálov v prvom trimestri a v treťom trimestri ukázalo, že signifikantne vyšší výskyt apoptózy sa pozoroval ako u decidua, tak u preeklampsie placenty (obrázok 30). A TUNEL + bunky na vizuálne pole 2,5 * 2,0 1,5 n = 5 1,0 0,5 5 n = 6 B TUNEL + bunky na vizuálne pole * n = n =% medián 25% 4 kontrola spontánneho potratu kontrola preeklampsie Obrázok 30: Apoptóza v prvom a treťom trimestri A: Semikvantitatívna analýza apoptotických signálov pri spontánnom potrate. B: Semikvantitatívna analýza apoptotických signálov v preeklampsii.

60 Výsledky 60 Obrázok 31 zobrazuje apoptózu v placente v treťom trimestri. Obrázok 31: Apoptóza v treťom trimestri. Jadrá buniek sú sfarbené do modra a apoptotické fragmenty fluoreskujú nazeleno.