Z Ústavu pre chov a chov zvierat Univerzity v Hohenheime Katedra chovu zvierat a

Z Ústavu pre chov a chov zvierat Univerzita v Hohenheime Predmetová oblasť: Chov zvierat a fyziológia výkonnosti Prof. Dr. R. Claus Zvýšenie tvorby butyrátu kŕmením rezistentným škrobom u ošípaných: Dôsledky mitózy a apoptózy regulácie sliznice hrubého čreva Dizertačnú prácu na získanie titulu doktor poľnohospodárskych vied, ktorú na Fakulte poľnohospodárskych vied predložil Joachim Mentschel z Landshutu 2004

Táto práca bola prijatá dňa 12. marca 2004 Fakultou poľnohospodárskych vied na univerzite v Hohenheime ako dizertačná práca na získanie titulu doktor poľnohospodárskych vied. Deň ústnej skúšky: 25. marca 2004 1. prodekan: prof. Dr. K. Stahr Spravodajca, prvý skúšajúci: prof. Dr. R. Claus Spoluspravodajca, 2. skúšajúci: Prof. Dr. H. Schenkel 3. skúšajúci: prof. Dr. R. Mosenthin

Prehľad literatúry 2 Prehľad literatúry 2.1 Prehľad tráviaceho systému ošípanej Tráviaci systém ošípanej je rozdelený na hlavu a kmeň. Črevo hlavy sa skladá z nosovej, ústnej a hltanovej dutiny. Kmeň možno rozdeliť na predné črevo (pažerák a žalúdok), stredné alebo tenké črevo (dvanástnik, jejunum a ileum), konečník alebo hrubé črevo (slepé črevo, hrubé črevo a konečník) a konečník (Liebich, 1998). Štruktúra kmeňa čreva je schematicky znázornená na obr. Obrázok 1: Schematické znázornenie kmeňa čreva u ošípaných (podľa Koch a Berg, 1990) 2I

Prehľad literatúry Dĺžka celého čreva ošípaných je 20 - 27 m, čo je asi 15-násobok dĺžky tela. Dvanástnik meria asi 0,95 m a celé tenké črevo s jejunom a ileom asi 15-20 m. Dĺžka hrubého čreva je asi 6 m, dĺžka hrubého čreva asi 5 m (Loeffler, 1991; Bucher & Wartenberg, 1991). 2.1.1 Morfologické princípy gastrointestinálneho traktu a jeho zvláštne vlastnosti Všetky úseky kmeňa čreva majú podobný základný plán (Liebich, 1998), existujú však značné rozdiely, pokiaľ ide o ich štruktúru steny (obr. 2). Tenké črevo pozostáva z početných krýpt a klkov. Krypty sú kratšie ako kryty hrubého čreva. Naproti tomu v hrubom čreve nie sú žiadne klky. Charakteristická je tvorba krýpt (glandulae intestinales), sú nerozvetvené a ležia blízko pri sebe. Jeho vlastné tráviace enzýmy sa nevylučujú zo sliznice hrubého čreva. Ďalej má hrubé črevo schopnosť vylučovať zle rozpustné látky, ako sú kovy. Okrem toho, na rozdiel od tenkého čreva, sú v hrubom čreve fyziologické nielen peristaltické, ale aj antiperistaltické pohyby (Bucher a Wartenberg, 1991). Obrázok 2: Rôzne stenové štruktúry tenkého a hrubého čreva (podľa Potten, 1992) 3

Prehľad literatúry 2.1.2 Morfologické zvláštnosti hrubého čreva Hrubé črevo sa vyvíja počas embryogenézy zo stredu a konečníka. Vzostupné hrubé črevo a proximálne priečne hrubé črevo sa vyvíjajú zo stredného čreva a distálne priečne hrubé črevo a zostupné hrubé črevo vznikajú z konečníka. Okrem tohto odlišného vývoja existujú aj tráviace fyziologické rozdiely, takže hlavné miesto fermentácie je v proximálnej oblasti, ale dá sa posunúť aj distálne v závislosti od prijatého substrátu. Ďalej sa tráviaca dužina čoraz viac zahusťuje v distálnej oblasti. Z týchto dôvodov sa hrubé črevo v tomto dokumente označuje ako proximálne a distálne hrubé črevo. Proximálna časť pozostáva zo stúpajúceho hrubého čreva a proximálnej oblasti priečneho hrubého čreva, distálnej oblasti distálneho priečneho hrubého čreva a zostupného hrubého čreva. 2.1.2.1 Všeobecná konštrukcia steny hrubého čreva Základný konštrukčný plán hrubého čreva pozostáva z rôznych vrstvených tkanív (obr. 3), od lúmenu smerom von sa označujú ako sliznica tunica, tela submukóza, tunica muscularis, tela subserosa a tunica serosa. Obrázok 3: Prierez hrubým črevom (Liebich, 1998) 4I

Prehľad literatúry 2.2 Úlohy gastrointestinálneho traktu Primárnou úlohou gastrointestinálneho traktu je rozložiť prijatú potravu na jej zložky do takej miery, aby sa dokázala vstrebať do vnútra tela. Tráviaci proces začína mechanickým rozpadom zložiek potravy v ústnej dutine. Po prehltnutí potravy sa strávia sacharidy, bielkoviny a tuky. Trávenie v strednom čreve prebieha prostredníctvom enzýmov. Prehľad vlastných enzýmov v tele počas odbúravania hlavných živín je uvedený na obr. Obrázok 5: Prehľad vlastných enzýmov v tele počas odbúravania hlavných živín (podľa Simon, 1995) Účinnosť enzýmov tenkého čreva v hrubom čreve kontinuálne klesá. Namiesto toho črevné baktérie a prvoky, ktoré štiepia sacharidy a bielkoviny, preberajú trávenie zvyšných zložiek potravy v hrubom čreve. Okrem vstrebávania minerálov a vody je úlohou hrubého čreva syntéza vitamínov B a K a hlavne 7

Prehľad literatúry Tab. 3: Molárne pomery acetátu, propionátu a butyrátu po 24 hodinách inkubácie ľudských výkalov s rôznymi uhľohydrátmi (podľa Cummings & Macfarlane, 1997) Výťažok substrátu SCFA (%) Molárne pomery (%) octan propionát butyrátový škrob 49 62 15 23 otrúb (pšenica, 40 64 16 20 ovsa) fruktooligosacharid - 78 14 8 pektínov 39 80 12 8 ostatných NSP 38 63 22 8 vrátane: guarová guma arabinogalaktán 62 43 59 57 27 31 11 11 zložky potravín ako celulóza, hemicelulózy, pentosany (Berggren et et al., 1993; Bourquin et al., 1993; Knudsen et al., 1993) vedú k miernej fermentácii butyrátu, zatiaľ čo sa dosahujú zvýšené koncentrácie butyrátu, najmä rezistentnými škrobmi. Tabuľka 4: Molárne pomery acetátu, propionátu a butyrátu po inkubácii výkalov ošípaných s rôznymi škrobmi po dobu 24 hodín (podľa Martin et al., 1998) Molárne pomery substrátu (%) octan propionátbutyrát surový pšeničný škrob 56 25 17 surový kukuričný škrob 62 21 16 surový hrachový škrob 62 21 15 surový amyloma kukuričný škrob 47 28 23 retrográdne 54 28 14 amyloma kukuričný škrob surový zemiakový škrob 55 19 25 11

Prehľad literatúry o udržiavaní homeostázy tkaniva. Úzko to súvisí s mitózou, pretože ak počet buniek v tkanive zostane rovnaký, vytvorí sa toľko buniek, ktoré sa stratí bunkovou smrťou (Kerr a kol., 1972). V súlade s tým musia v tkanivách s konštantnou produkciou buniek existovať presne definované mechanizmy na reguláciu straty buniek (Ansari & Hall, 1992). Ich úlohou je odstraňovať nadbytočné, poškodené alebo infikované bunky (Thompson, 1995). Chyby v apoptóze môžu viesť k rôznym klinickým obrazom. Ak mitotická rýchlosť zostáva rovnaká, zvýšenie vedie k atrofii tkaniva. Na jednej strane môže aktivácia pro-apoptotických kontrolných mechanizmov viesť k degenerácii tkaniva (Que & Gores, 1997), na druhej strane chyby v apoptóze uľahčujú transformáciu normálneho tkaniva na neoplastické. Z týchto dôvodov sú diskutované farmakologické stratégie týkajúce sa ovplyvňovania apoptózy. Inhibícia apoptózy epitelových buniek by teda mohla zlepšiť procesy obnovy a opravy tkanív v gastrointestinálnom trakte, zatiaľ čo indukcia apoptózy v malígnych tkanivách by mohla mať vysoký terapeutický prínos (Que & Gores, 1997). 2.4.1 Delenie buniek: mitóza Proces bunkového delenia, prostredníctvom ktorého sa vytvára nová bunka s rovnakým počtom chromozómov ako v pôvodnej bunke, sa nazýva mitóza. Pri mitóze sa každý chromozóm rozdelí na dve rovnaké časti, ktoré prechádzajú na opačné konce bunky. Po delení buniek má potom každá z dvoch dcérskych buniek rovnaký počet chromozómov a génov ako pôvodná bunka. Jednoducho postavené prvoky a niektoré mnohobunkové druhy sa množia mitózou; Týmto procesom (hyperplázia) navyše rastú živé bytosti a použité bunky sú nahradené. To je v kontraste s rastom buniek (hypertrofia), ktorý sa má chápať iba ako zväčšenie bunkovej hmoty alebo veľkosti bunky. V sliznici gastrointestinálneho traktu vychádzajú enterocyty vždy z kmeňových buniek, ktoré sa nachádzajú v spodných oblastiach krypty (Bach et al., 2000). Na identifikáciu proliferujúcej bunky je potrebné detegovať špecifické zmeny, ako sú napríklad génové produkty spojené s proliferáciou. Medzi zástupcov týchto génov spojených s proliferáciou patria: diskutovali o onkogénoch. Chronologický bunkový cyklus (obr. 7) má veľký význam pre identifikáciu mitózy. Toto je rozdelené do štyroch fáz (G1, S, G2 a M). Počas S Pha- 14 I

Prehľad literatúry prebieha syntézou DNA počas mitózy fázy M s delením chromozómov. Vo fázach G1 a G2 (medzery) sa pripravujú procesy v nasledujúcich fázach S a M. Bunky, ktoré neprechádzajú bunkovým cyklom, sú vo fáze G0. Začiatok mitózy MR G2 G0 G1 S Začiatok syntézy DNA Obr. 7: Schematické znázornenie bunkového cyklu Detekciu mitózy možno určiť pomocou určitých markerov, ako je napríklad PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) a detekcia jadrového antigénu (Ki67) (Potten & Loeffler, 1990). PCNA proteín sa syntetizuje v deliacich sa bunkách. Protilátky namierené proti tomuto proteínu reagujú s deliacimi sa bunkami vrátane nádorových buniek, ale nie s bunkami v pokojovej fáze (Mathews et al. 1984). Protilátka Ki67 detekuje jadrový antigén, ktorý je prítomný v proliferujúcich bunkách, ale nie v pokojových bunkách. Bunky v cyklických fázach vrátane G1 sú Ki67 pozitívne, zatiaľ čo bunky vo fáze G0 neexprimujú antigén (Baisch & Gerdes 1990). 15

Prehľad literatúry Obr. 10: Schematické znázornenie apoptózy (podľa Kerra, 1993) 2.4.4.2 Priebeh apoptózy Apoptózu je možné iniciovať pomocou rôznych kontrolných mechanizmov (obr. 11). V tejto súvislosti je potrebné rozlišovať medzi receptorom sprostredkovanou cestou apoptózy a mitochondriálnou cestou. 21. deň

Prehľad literatúry Dráha apoptózy sprostredkovaná receptorom je iniciovaná prostredníctvom receptorov, ako je napríklad CD95. Väzba ligandu CD95 na CD95 indukuje signálny komplex, ktorý prijíma molekuly prokaspázy 8 pomocou FADD (proteín domény smrti spojený s Fas), a je preto zodpovedný za aktiváciu kaspázy 8 (Hengartner, 2000). Mitochondrie hrajú ústrednú úlohu pri kontrole apoptózy. Mitochondriálna dráha môže byť vyvolaná extracelulárnymi faktormi alebo poškodením DNA. Do tohto regulačného mechanizmu sú zapojené proteíny rodiny Bcl-2. Pro- a anti-apoptotickí predstavitelia tejto rodiny prichádzajú do styku v mitochondriách a kontrolujú uvoľňovanie rôznych molekúl, ako je cytochróm c, ktorý spolu s apaf-1 a prokaspázou 9 môže aktivovať efektorové kaspázy. Ďalšie detailné mechanizmy zobrazené na diagrame nie sú v tejto práci ďalej diskutované; podrobnejšie vysvetlenie je možné nájsť v publikácii Hengartner (2000). Obrázok 11: Schéma najdôležitejších dráh apoptózy (vľavo: dráha apoptózy sprostredkovanej receptorom; vpravo: dráha mitochondriálnej apoptózy, podľa Hengartnera, 2000) 22 I.

Prehľad literatúry Členovia rodiny bcl-2 Mitochondrie Uvoľňovanie cytochrómu c Aktivácia kaspázovej kaskády Apoptóza Obr. 12: Model apoptózovej kaskády prostredníctvom Bcl-2, mitochondrie, cytochrómu c a kaspáz 2.4.5.1 Apoptóza-regulačné proteíny: Ako protonkogén bol použitý Bcl-2 rodina Bcl-2. identifikované. Gén bol prvýkrát objavený v B-bunkovom lymfóme. Pokusy na myších bunkových líniách tiež preukázali účinok bcl-2 na apoptózu (Vaux et al., 1988). Zatiaľ čo Bcl-2 sa nachádza v mnohých fetálnych tkanivách, v dospelých tkanivách je tento proteín exprimovaný hlavne v rýchlo sa deliacich a diferenciačných bunkách. Pri ďalších výskumoch sa našlo množstvo génov, ktoré majú sekvenčnú homológiu s bcl-2 (Yang a Korsmeyer, 1996; Reed, 1997). Charakterizácia aminokyselinovej sekvencie, biologický účinok a funkcia viedli k rôznym pozorovaniam. V súlade s tým rodina Bcl-2 proteínov zahrnuje oba Ver 25

Recenzia literatúry Bcl-2, Bcl-X-L, Bid alebo sami (Sattler et al., 1997). Bax pôsobí proti antiapoptotickému proteínu Bcl-2; čím vyššie sú koncentrácie Baxu v porovnaní s Bcl-2, tým väčší je jeho účinok. Relatívne pomery homodimérov Bax/Bax, heterodimérov Bcl-2/Bax a homodimérov Bcl-2/Bcl-2 sú rozhodujúce pre uskutočnenie apoptózy. Ak prevládajú Bax homodiméry, potom dochádza k bunkovej smrti; prevaha heterodimérov Bax/Bcl-2 má tendenciu viesť k prežitiu buniek (Sato a kol., 1994). Avšak v niektorých štúdiách sa tiež ukázalo, že bez ohľadu na stupeň dimerizácie môžu Bcl-2 a Bcl-x inhibovať apoptózu alebo že Bax môže tiež apoptózu podporovať (St Clair a kol., 1997; Zha & Reed, 1997) (obr. 13). Okrem toho sa zdá, že proapoptický účinok Bak je nezávislý od heterodimerizácie s Bcl-X-L a Bcl-2 (Simonian et al., 1997). a: bax bcl-2 bcl-2 bax b: Obr. 13: Schémy znázorňujúce interakciu proteín-proteín členov rodiny bcl-2 (a: upravené od Mathers, 1998; b: Sato et al., 1994) 27