Značenie bielkovín Ako si zvoliť štítok pre váš proteín

Sara Klink

Dátum zverejnenia: 7/2019; tpub_215

Abstrakt

Značenie proteínov je dôležitým aspektom analýzy proteínov. Ak budete môcť označiť svoj proteín pre rôzne aplikácie, vrátane purifikácie, rozbaľovacích testov, imunotestov a ďalších, môže vám pomôcť definovať funkciu proteínu. Ale ktorú značku by ste si mali zvoliť? Tento článok popisuje niekoľko možností pre afinitné alebo reportérske značky a reagencie, ktoré vám môžu pomôcť pri vašich experimentoch.

Úvod

Proteíny alebo polypeptidy sú neoddeliteľnou súčasťou bunkovej funkcie. Sú to enzýmy, ktoré tvoria cesty energetického metabolizmu, bunkového rastu, signalizácie, mitotického cyklu a bunkovej smrti. Schopnosť izolovať a detekovať špecifické proteíny nám umožňuje pochopiť, ktoré proteíny sú súčasťou väčších komplexov, ktoré proteíny interagujú a aké sú ich úlohy v bunkovej funkcii a chorobe. Jedným zo spôsobov, ako preskúmať funkciu proteínu, je pridanie značky k požadovanému proteínu a jeho oddelenie od bunkového lyzátu, aby sa študoval proteín.

Fúzne značky môžu byť polypeptidy, malé proteíny alebo enzýmy pridané k amino (N) alebo karboxy (C) koncu proteínu. Značenie sa môže uskutočniť klonovaním do vektorov alebo sa môže pridať pomocou úpravy génu CRISPR-Cas9 na označenie endogénneho proteínu. Použitím afinitnej značky môžete izolovať alebo imobilizovať proteín pre ďalšie proteomické štúdie.

Zatiaľ čo vedci bežne označujú proteín, aby ho purifikovali z bunkového lyzátu a použili izolovaný proteín v biochemických testoch, peptidový tag dokáže viac. Napríklad proteíny označené epitopom je možné detegovať pomocou protilátky špecifickej pre značku, ak neexistujú žiadne protilátky špecifické pre váš proteín. Okrem toho môžu značky tiež kvantifikovať proteíny, študovať proteínové komplexy a určovať, či je proteín vo vnútri alebo mimo bunky. Môžete si dokonca predstaviť umiestnenie proteínu v bunke kvôli značke na vašom proteíne.

Ktorý proteínový štítok je teda vhodný pre vaše experimenty? Ďalej uvádzame zoznam možností označovania proteínov pomocou nástrojov, ktoré vám môžu pomôcť.

Polyhistidíny

Jednou z najjednoduchších a najmenších značiek je značka polyhistidínu alebo značka 6XHis. Typicky je táto peptidová značka tvorená šiestimi histidínovými aminokyselinami, ktoré môžu byť umiestnené na N alebo C konci proteínu. Vďaka svojej malej veľkosti má značka His tendenciu nemeniť štruktúru proteínu, čo je užitočné pre následné testy. Okrem toho sa značka His môže viazať na ióny kovov, ako sú Ni 2+, Zn 2+ a Cu 2+, čo je užitočné na čistenie alebo imobilizáciu fúznych proteínov.

Polyhistidínová značka funguje dobre na rýchle čistenie proteínov exprimovaných v E. coli, ale pre proteíny exprimované v bunkách cicavcov alebo hmyzu znamená väčší počet histidínových zvyškov vyššiu väzbu na pozadie. Preto, aby sa zvýšila čistota proteínu, je potrebné prísne premyť kovové živice, ktoré viažu proteíny označené His. Na zlepšenie čistenia možno navyše použiť denaturačné činidlá, ako je 8M močovina alebo 6M guanidín HCl, s membránou označenou His alebo nerozpustnými proteínmi.

Ak chcete do proteínu pridať značku His, klonujte ORF do vektora, ktorý značku nesie. V závislosti na použitom promótore exprimujte označený proteín v bakteriálnych, cicavčích alebo hmyzích bunkách. Alternatívne môžete na expresiu proteínu použiť bezbunkové expresné systémy. Na prečistenie proteínu môžete na bunkové lyzáty použiť magnetické guľôčky (napríklad MagneHis ™ Protein Purification System) alebo nemagnetické živice (napr. HisLink ™ Protein Purification System). Ak je váš proteín označený His exprimovaný v systéme na báze králičieho retikulocytového lyzátu, je systém MagZ ™ Protein Purification System vhodný na čistenie proteínov s minimálnym obsahom hemoglobínu. Po elúcii z purifikačnej matrice je váš označený proteín pripravený na ďalšie použitie.

Purifikácia proteínov označených polyhistidínom

štítok

Glutatión-S-transferáza

Glutatión-S-transferáza (GST) je afinitná značka používaná pre proteíny exprimované v E. coli na čistenie označených proteínov od bakteriálnych lyzátov. Táto 26kDa peptidová značka je súčasťou rodiny cystolických proteínov prítomných v eukaryotoch, čo ju robí menej užitočnou pri pokuse o izoláciu proteínov z eukaryotických buniek kvôli konkurencii iných proteínov. Označenie eukaryotických proteínov pomocou GST zvyšuje rozpustnosť fúzneho proteínu, ak je exprimovaný v baktériách. Okrem toho môžu byť proteíny označené GST exprimované vo vysokých hladinách v baktériách, ale môžu tvoriť inklúzne telieska v dôsledku agregácie proteínov. GST značka môže byť pridaná k N alebo C koncu sledovaného proteínu.

GST má silnú afinitu k glutatiónu, čo znamená, že môžete zachytávať proteínové fúzie GST na imobilizovanej matrici, ako sú guľôčky potiahnuté glutatiónom. Táto väzbová charakteristika sa používa na čistenie proteínov a na zachytávanie proteínov, ktoré by sa mohli viazať na váš proteín (napr. Rozbaľovacie testy).

Zatiaľ čo proteíny s GST tagom môžu byť vysoko exprimované a rozpustnejšie, veľká veľkosť tagu môže interferovať s funkciou proteínu v následných aplikáciách. Možno budete schopní štiepiť svoj proteín z GST tagu, čím znížite možnú funkčnú interferenciu. Pokiaľ sa exprimovaný proteín agregoval do inklúzneho telieska, stáva sa problematické afinitné čistenie pomocou glutatiónu. Pre úspešné naviazanie na glutatión je potrebné správne zložiť GST a aj keď sa značka GST znovu zloží, nemusí byť váš požadovaný proteín.

Ak chcete použiť značku GST, začnite klonovaním kódujúcej oblasti pre požadovaný proteín do vektora a exprimujte označený proteín v E. coli. Použitie indukovateľného promótora na kontrolu expresie cieľového proteínu môže pomôcť pri proteínoch, ktoré sú toxické pre bakteriálne bunky. Akonáhle sú bakteriálne bunky lyžované (napr. Pomocou lyzačného činidla FastBreak ™ Cell), môžete purifikovať proteín označený GST pomocou živice na báze glutatiónu (napr. MagneGST ™ Protein Purification System). V závislosti od použitého klonovacieho vektora môže existovať štiepne miesto pre proteázu na odstránenie značky GST z vášho proteínu. Akonáhle je váš proteín eluovaný alebo štiepený, je pripravený na analýzu.

Čistenie fúzií GST-proteínov

Proteín HaloTag®

Zatiaľ čo značky GST a 6XHis sú užitočné na izoláciu proteínov exprimovaných v bakteriálnych bunkách, existujú možnosti značenia, ktoré sú kompatibilné s bunkami E. coli aj s bunkami cicavcov. Proteín HaloTag® s veľkosťou 34 kDa ponúka tomuto expresnému systému flexibilitu. Na rozdiel od iných značiek, ktoré na čistenie proteínov používajú nekovalentné interakcie, základom technológie HaloTag® je kovalentná väzba medzi proteínom HaloTag® a jeho ligandom. Vďaka sile kovalentnej väzby môžete označený proteín umyť za prísnych podmienok a v podstate vylúčiť akékoľvek nešpecifické pozadie proteínu. Máte obavy z veľkosti štítku, ktorý ovplyvňuje funkciu vášho proteínu? Žiaden problém! Na odštiepenie proteínu z HaloTag stačí použiť proteázu TEV a purifikovaný neoznačený proteín je pripravený na následnú analýzu.

Jednou z výziev exprimujúcich proteíny v bakteriálnych bunkách je rozpustnosť. Eukaroytické proteíny nie sú metylované a postrádajú ďalšie posttranslačné modifikácie, keď sú syntetizované v E. coli, čo ich robí náchylnými na tvorbu inklúznych teliesok. Fúzne značky, ako sú proteíny HaloTag®, môžu zvyšovať rozpustnosť rekombinantných proteínov a dokonca zvyšovať expresiu v baktériách, čo uľahčuje čistenie vášho proteínu, ktorý vás zaujíma. Expresiou fúzie proteínu HaloTag v bunkách cicavcov budú prítomné posttranslačné modifikácie, ktoré viac odrážajú fungovanie proteínu v bunkových podmienkach. Použitím imobilizovanej matrice, ako je živica potiahnutá ligandom HaloTag®, môžete čistiť iba proteíny pomocou prítomného HaloTag alebo použiť v rozbaľovacích testoch na zistenie, aký proteín alebo proteíny sa viažu na váš požadovaný proteín. Týmto spôsobom môžete lepšie pochopiť proteínové interakcie.

Aplikácie však nekončia iba pri bielkovinách: pri interakciách s bielkovinami a pri čistení bielkovín. Ak chcete preskúmať, na akú sekvenciu DNA sa váš proteín viaže, môže technológia HaloTag® pomôcť dešifrovať interakciu proteín: DNA. Čo použiť imunochémiu? Máme na to protilátku. Máte záujem o zobrazovanie buniek? Keď je váš proteín fúzovaný s proteínom HaloTag® a fluorescenčnými ligandmi HaloTag®, môžete zistiť, kde je váš proteín lokalizovaný, či je obchodovaný a ako rýchlo sa otočí. Existujú dokonca aj ligandy pre mikroskopiu so super rozlíšením a FACS. Viac informácií o technológii HaloTag® sa dozviete tu.

Ak chcete začať s technológiou HaloTag®, naklonujte kódujúcu oblasť pre váš požadovaný proteín do tradičných alebo Flexi® klonovacích vektorov a pridajte HaloTag na N alebo C koniec. Prípadne môžete vyhľadať ktorýkoľvek z tisícov vopred pripravených klonov HaloTag® dostupných od spoločnosti Kazusa. Keď máte svoj klon, môžete ho použiť na akúkoľvek aplikáciu na analýzu proteínov. V závislosti na tom, čo chcete robiť ďalej, možno budete potrebovať purifikačný systém (napr. HaloTag® systém na čistenie bielkovín z cicavcov alebo HaloTag® systém na čistenie bielkovín) alebo rozbaľovací test (napr. HaloTag® cicavce na rozťahovanie). Pre zobrazovacie štúdie budete musieť zvoliť správny fluorescenčný ligand (napr. Ligandy HaloTag® alebo ligandy Janelia Fluor® HaloTag®). Ak máte záujem o imunologické štúdie, pomôže vám Anti-HaloTag® pAb. Pre proteínové interakcie existujú systémy PPI NanoBRET ™ pre štúdie proteín: proteín a systém HaloCHIP ™ pre skúmanie interakcií proteín: DNA.

Vymeniteľná technológia označovania HaloTag®

Obrázok 1. Táto ilustrácia ukazuje, ako je proteín HaloTag® fúzovaný s požadovaným proteínom a kovalentná väzba medzi HaloTag a jeho ligandom.

Zatiaľ čo väčšina peptidových značiek, o ktorých sa diskutovalo vyššie, sú afinitné značky na použitie pri purifikácii proteínov, rozbaľovacích testoch alebo metódach, ktoré viažu označený proteín na pevnú matricu, existujú aj iné typy značiek pre rôzne aplikácie. Od kvantifikácie proteínov po endogénne značenie je možné na sledovanie značeného proteínu v bunke použiť bioluminiscenčnú značku alebo dokonca malý reportérový proteín fúzovaný s proteínom, čím sa eliminuje potreba protilátok.

HiBiT

Menšia je pre veľa vecí lepšia a malá značka s 11 aminokyselinami, ktorá sa nazýva peptid, HiBiT je skvelá na označenie proteínu. Ak chcete preskočiť tradičné klonovanie, môžete dokonca použiť úpravu génu CRISPR a pridať značku HiBiT k endogénnemu proteínu. To má výhodu v štúdiu proteínu bez nadmernej expresie, ktorá sa zvyčajne pozoruje pri použití exogénnej expresie z plazmidu. Udržiavaním bunkových proteínov v rovnakých pomeroch, aké sa nachádzajú v bunke, môžete študovať zmeny vo svojom značenom proteíne za fyziologických podmienok. Táto výhoda znamená menej artefaktov z nadmernej expresie proteínu a viac biologicky relevantných výsledkov. Protokol CRISPR na pridanie peptidovej značky je jednoduchý a malý, ak HiBiT ponúka vysokú efektivitu úprav.

Samotný HiBiT nie je bioluminiscenčný. Len čo sa však pridá detekčné činidlo, ktoré obsahuje komplementárny proteín LgBiT, vytvorí sa jasný luminiscenčný signál. Kvantifikovateľný signál je ľahko merateľný pomocou luminometra. Bioluminiscenčné testy sú citlivé a poskytujú detekciu až na nanomolárne úrovne. Chcete skúmať extracelulárne alebo vylučované proteíny? Máme na to reagenčný systém! Kombinujte kvantifikáciu celkového značeného proteínu s našim lytickým systémom a pomocou nášho extracelulárneho systému preskúmajte hladiny vylučovaných proteínov. Môžete dokonca eliminovať potrebu protilátky a pomocou nášho bioluminiscenčného blotovacieho systému detekovať proteíny blokované na membránu. Ak je LgBiT exprimovaný intracelulárne, môžete kineticky zistiť množstvo proteínov značených HiBiT v živých bunkách. Tu sa dozviete, ako môžete použiť HiBiT na značenie bielkovín.

Ak chcete začať používať HiBiT, môžete klonovať svoje ORF do jedného z našich tradičných vektorov MCS alebo Flexi® alebo pomocou značky CRISPR pridať značku do genomickej sekvencie. Umiestnite štítok tam, kde je to potrebné pre optimálnu detekciu. Akonáhle je váš proteín označený HiBiT, určite si, ktorá metóda najlepšie vyhovuje vašim štúdiám (Nano-Glo® HiBiT Lytic, Intracellular or Blotting Systems).

Prehľad lytického detekčného systému Nano-Glo® HiBiT

NanoLuc® luciferáza

Niekedy to urobí iba reportér. Našťastie je luciferáza NanoLuc® 19kDa enzým, vďaka čomu je bioluminiscenčný proteín dostatočne malý na to, aby ste si mohli zajazdiť s iným proteínom bez toho, aby zasahovali do normálnych bunkových funkcií. Podobne ako HiBiT, NanoLuc poskytuje citlivú, ľahko kvantifikovateľnú proteínovú fúznu značku. Reportérový enzým však nevyžaduje komplementačného partnera, čo zjednodušuje jeho použitie v niektorých aplikáciách. Jas a malá veľkosť znamená, že luciferáza NanoLuc® sa zmestí do vírusových častíc bez toho, aby spôsobovala ťažkosti. Prečítajte si, ako to dokázali títo virologickí vedci. Ako reportérový enzým môže luciferáza NanoLuc® pomôcť zistiť bunkovú polohu fúzneho proteínu a tiež sledovať cestu, ktorou by váš proteín mohol ísť. Okrem toho môžu byť fúzne proteíny NanoLuc® použité v aplikáciách založených na bioluminiscenčnom rezonančnom prenose energie (BRET) na štúdium interakcií proteín: proteín alebo zapojenie cieľa s malou molekulou. Získajte viac informácií o schopnostiach tohto reportérskeho enzýmu.

Ak chcete vytvoriť proteínovú fúziu s luciferázou NanoLuc®, budete musieť naklonovať ORF do reportérového vektora NanoLuc® a umiestniť NanoLuc na N alebo C koniec. V závislosti od vašej aplikácie môžete použiť lytický detekčný systém (napr. Nano-Glo® Luciferase Assay System) alebo detekciu živých buniek (napr. Nano-Glo® Live Cell Assay System).

Zhrnutie

Výber značky pre váš proteín je založený na vašich experimentálnych potrebách. Či už potrebujete afinitný štítok na čistenie proteínov, chcete vytvoriť jediný fúzny proteín, ktorý sa použije v rôznych metódach analýzy proteínov, alebo pridať endogénny štítok pomocou úpravy génu CRISPR-Cas9, k dispozícii je množstvo štítkov a reportérskych enzýmov.