56. nefrektómia v kombinácii s diétou s vysokým obsahom solí a indukciou inhibície oxidu dusnatého

Zhrnutie

Je opísaný dvojkrokový postup na stanovenie chronického zlyhania obličiek (CRF) u potkana Lewis chirurgickým odstránením 5/6 obličkovej hmoty. Kombinácia chirurgického zákroku, inhibície NOS a diéty s vysokým obsahom solí vedie k modelu podobnému ľudskej CKD, ktorý umožňuje štúdium kauzálnych mechanizmov a vývoj nových terapeutických zásahov.

Abstrakt

Úvod

Vďaka svojej progresívnej povahe, následnému konečnému ochoreniu obličiek a súvisiacej kardiovaskulárnej morbidite a mortalite predstavuje CKD rastúci problém v oblasti verejného zdravia. Preto je spomalenie progresie CKD veľkou zdravotnou prioritou. Pretože CKD je charakterizovaná komplexnými poruchami homeostázy, na štúdium vývoja a progresie CKD sú potrebné integrujúce zvieracie modely. Oblička je tvorená množstvom rôznych typov buniek, ktoré navzájom interagujú. Táto zložitosť sa nedá napodobniť in vitro.

Protokol

Všetky experimenty sa uskutočňujú v súlade s etickými pokynmi pre experimenty na zvieratách Utrechtského výboru pre laboratórne zvieratá. Protokol sa vedie pod vedením a schválením autorovho inštitútu pre starostlivosť a použitie zvierat.

CKD sa indukuje u samcov inbredných potkanov Lewis (Charles River, Sulzfeld, Nemecko) vo veku 8 týždňov. Potkany sa chovajú za štandardných podmienok v prostredí s kontrolovaným svetlom, teplotou a vlhkosťou.

  1. Sterilizujte chirurgické nástroje:
    • 1 študentský kliešť 1-2 zuby 12 cm
    • 1 študentské štipce so štandardným vzorom
    • 2 kliešte Semken
    • 1 nožnice Mayo
    • 1 študentka Iris nožnice
    • 1 Držiak ihly Olsen-Hegar s nožnicami
    • Deka
  2. Skontrolujte zoznam zásob:
    • Operačný stôl s hrejivou podložkou a lampou
    • 02, izoflurán
    • tkanivo
    • Holiaci strojček
    • Váhy
    • Sterilná prevádzková nastavená hodnota
    • Sterilná gáza 5x5 a 10x10
    • 70% alkoholu
    • 0,9% roztok NaCl
    • 1 ml injekčná striekačka
    • Ihly (25 G)
    • Gélové penové podložky: Spongostan
    • Vicryl 4.0 a 5.0
    • Buprenorfín 0,03 mg/kg (zriedený 1:10 vo fyziologickom soľnom roztoku)
    • Po operácii vyčistiť klietku pre potkany

2. Pravá strana Uninefrektómia

3. Ľavá strana Medzisúčet nefrektómie

  1. O sedem dní neskôr sa vykonajú rovnaké prípravy vľavo pre pravú stranu, ako je opísané v bodoch 2.1 až 2.5. Pred operáciou sa počíta množstvo obličkového tkaniva, ktoré je potrebné odobrať, čo je približne 2/3 hmotnosti pravej obličky. Pred chirurgickým zákrokom si pripravte malé kúsky gélovej peny (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey).
  2. Okolo horného pólu ľavej obličky položte ostré nožnice a jedným ťahom resekujte horný pól (umiestnenie nožníc nájdete v časti Obrázok 3). Okamžite zakryte kúskom gélovej peny a jemným tlakom stlačte sterilnú gázu.
  3. Opakujte s dolným pólom obličky ako v 3.3.
  4. Zdvihnite obličku, aby ste zabránili zrážaniu na pokožke. Udržujte mierny tlak na obidve gélové penové vložky pomocou sterilnej gázy, kým sa krvácanie nezastaví. Ak krvácanie pokračuje, pridajte ďalšiu penovú podložku.
  5. Zvyšnú obličku vložte pomocou lepiacej gélovej penovej vložky do brucha. Zatvorte svaly a pokožku a postupujte podľa 2.9-2.12.

  1. Rovnaký postup sa vykonal aj pri fingovanom sledovaní, aby sa odhalili obličky. Namiesto eradikácie obličky alebo prerezania tyčiniek o týždeň neskôr sa obe obličky v týždennom intervale rozpadnú bez toho, aby sa obťažovali narušením činnosti nadobličiek. Uzatvorenie rany a pooperačná starostlivosť sú identické do 2.11 a 2.12.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Po subtotálnej nefrektómii zostáva približne 1: 6 z celkovej renálnej hmoty. Obrázok 4 ukazuje váhu odstránenej časti pravej obličky so strednou a štandardnou odchýlkou ​​v dvoch predchádzajúcich experimentoch. Jeden by mal mať na pamäti, že v týždni po UNX dôjde k hypertrofii ľavej obličky, čo naznačuje, že váha, ktorú je potrebné vypočítať na základe hmotnosti pravej obličky, má za následok vždy menej ako 5/6. Pretože však nie je možné určiť váhu ľavej obličky počas operácie, je to presný spôsob odstránenia asi 5/6 pôvodnej obličkovej hmoty.

V priebehu času sa u potkanov s CKD vyvinula hypertenzia, urémia, anémia, proteinúria a výrazné zníženie GFR a ERPF. Po 6 týždňoch sa etablovala ČKD, vhodný časový bod na testovanie záchranných opatrení. V priebehu času sa pozoruje prudký progresiu hypertenzie a proteinúrie, zatiaľ čo hematokrit a funkcia obličiek (GFR a ERPF) vykazujú mierne zhoršenie. (Obrázok 5). Ďalšími príznakmi, na ktoré sme sa v našich experimentoch nesústredili, sú poruchy metabolizmu fosforečnanu vápenatého a lipidov a mnoho ďalších. V závislosti od stresu na potkanoch sa vývoj CKD môže veľmi líšiť 14, 15, 2. Na vyvolanie vysokého krvného tlaku a endotelovej dysfunkcie sme použili stravu s vysokým obsahom solí a blokátor NO.

Progresiu zlyhania obličiek sleduje zber moču (používaný na meranie množstva bielkovín a kreatinínu), krvi (močovina a kreatinín v plazme) a systolický krvný tlak. Sme si vedomí, že vývoj vysokého krvného tlaku je možné presnejšie sledovať pri použití telemetrie namiesto pletysmografie chvostovej manžety. Klírens kreatinínu je možné vypočítať, ale má tendenciu podceňovať pokles GFR v dôsledku rozsiahlej tubulárnej sekrécie kreatinínu u potkanov 16, čo zdôrazňuje význam zlatého štandardného spôsobu stanovenia funkcie obličiek stanovením klírensu inulínu a PAH 17, 18, 19 . Koeners a kol. popísal celý postup 20. Klírens inulínu a PAH vypočítaný z ich koncentrácie vo vzorke moču (U), prietoku moču (V) a ich plazmatickej koncentrácie (P). Predtým sme v tomto modeli demonštrovali významné zníženie GFR a ERPF pomocou klasickej technológie klírensu, zatiaľ čo to bolo menej zrejmé zo zmien plazmatického kreatinínu, plazmatickej močoviny alebo klírensu kreatinínu 13.

kombinácii
Obrázok 1. Časová línia L-NNA, diéta s vysokým obsahom solí, UNX a SNX. Uvádzajú sa pozdĺžne merania funkcie obličiek a stanovený časový bod ukončenia. Pri dlhšom sledovaní po potrebe SNX možno v priebehu času pokračovať v 6% výžive NaCl.

98fig2.jpg "/>Obrázok 2. Disekcia nadobličiek. Aby ste odstránili nadobličku bez toho, aby ste ju narušili, vložte do tuku medzi obličkami a nadobličkami kliešte a pohybujte sa od pólu cievy až po koniec, ako to naznačuje červená čiara. Ilustrácia adaptovaná z 20. amerického vydania Anatomy of the Horror of the Human Body, 1918.

nefrektómia
Obrázok 3. Medzisúčet nefrektómie. Červené čiary označujú ostrie. Ilustrácia adaptovaná z 20. amerického vydania Anatomy of the Horror of the Human Body, 1918.

kombinácii
Obrázok 4. Porcia odobrala obličkové tkanivo po subtotálnej nefrektómii v dvoch rôznych experimentoch. Exp 1, n = 16, exp 2, n = 23.

diétou
Obrázok 5. Vývoj zlyhania obličiek u CKD potkanov sa skončil 6 týždňov po SNX (sdashed lines n = 5) vs zdravé kontroly (pdashed lines n = 5) a CKD potkany skončili 12 týždňov po SNX (£ n = 8) vs zdravé kontroly (• n = 8 ). CKD potkany dostávali L-NNA do 4. týždňa a stravu s vysokým obsahom solí od 1. týždňa do ukončenia (nie je znázornené v grafe). SNX indukuje hypertenziu (merané pletysmografiou chvosta) (A), Urémia (B), anémia (C) a proteinúria (D) a významné zníženie GFR (E) a ERPF (F) 13. * Vyžaduje sa zadané p predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Chirurgické odstránenie 5/6 obličkovej hmoty u potkana Lewis v kombinácii s diétou s vysokým obsahom solí a dočasnou inhibíciou NOS vedie k modelu CKD, ktorý sa podobá ľudskému CKD a umožňuje skúmanie kauzálnych mechanizmov a účinnosti terapeutických zásahov CKD.

Model 5./6. Nefrektómie je dobre známym a široko popísaným modelom pre CKD. Jednoduché odstránenie 5/6 obličkovej hmoty však nespôsobilo okamžite zlyhanie obličiek u všetkých kmeňov potkanov. Na štúdium účinkov bunkových terapií pri CKD používame potkany Lewis, pretože dostupnosť potkanov GFP + Lewis môže sledovať sledovanie buniek pomocou darcovských buniek u potkana (nonGFP +). Krysa Lewis je relatívne rezistentná na vývoj zlyhania obličiek a vývoj CKD je v porovnaní s inými kmeňmi 22, 15 pomalý. Preto je odstránenie 1/6 obličkovej hmoty kombinované s úbytkom NO a diétou s vysokým obsahom solí, pretože to pripomína niekoľko aspektov ľudskej CKD, ako je vysoký príjem solí a endotelová dysfunkcia. Čitatelia by mali mať na pamäti, že potreba kombinácie 5./6. Nefrektómie s diétou s vysokým obsahom solí a/alebo bez únavy závisí od kmeňa potkanov použitého na experimenty.

5/6 nefrektómiu sme vykonali skôr v dvojkrokovom postupe, ako v jednokrokovom, pretože sa to považuje za menej stresujúce pre zviera, je spojené s menšou úmrtnosťou spojenou s chirurgickým zákrokom a je uprednostňované našou testovacou komisiou na zvieratách. Na dosiahnutie obličky sme uprednostnili radšej rez do boku ako laparatómiu, pretože laparotómia je v porovnaní s rezom do boku spojená s vyšším rizikom infekcie rany, uvoľnením stehov, subkutánnou herniáciou disku a adhéziou do čreva. Ďalej, ak experimentálny návrh zahŕňa intervenciu s brušným rezom - ako je to v našich experimentálnych štúdiách o podávaní buniek kostnej drene do renálnej artérie zvyšnej obličky, ktoré vykonávajú laparotómiu pre SNX, nie je potrebné sa vyhnúť opakovaným laparotómiám.

Po chirurgickom odstránení 5/6 obličkovej hmoty môže vzniknúť niekoľko kritických problémov. Počas UNX môžu byť ťažkosti so stabilizáciou obličky, pretože okolitý tuk sa ľahko uvoľní. Na odhalenie obličky možno použiť dve metódy. 1) Na uchopenie obličkových ciev použite menšie kliešte. Jemným pohybom smerom nadol od dolného pólu obličky smerom k vaskulatúre a jemným ťahaním, až kým obličku nestabilizujete. 2) Tupými kliešťami opatrne vyberte obličku z brucha. Po odhalení obličky sa dá gáza použiť na zastavenie krvácania, ku ktorému dôjde počas tohto procesu. Aby sa zabránilo krvácaniu, tuk začne ťahať za dolný pól obličky, kde je tuk silne pripojený k obličke.

Je dôležité vytvárať medzi uzlom okolo obličkovej cievy a obličkami, aby ste zabránili krvácaniu po odstránení obličky, pretože uzol z dôvodu prichádzajúceho prietoku krvi skĺzava z obličkových ciev a rýchlo vyplňuje bruško krvou. Na odstránenie krvi možno použiť gázu a na zastavenie krvácania použiť tlak. Pomocou klieští chyťte obličku a vytvorte novú ligatúru. Ak nie je možné zistiť obličkové cievy, držte tlak, kým sa krvácanie nezastaví. 1 ml fyziologického soľného roztoku, aby sa zabránilo dehydratácii v dôsledku krvácania do brušnej dutiny a počkajte asi 5 minút, kým zatvoríte svalovú a kožnú vrstvu. Nasledujúce dni pozorne sledujte potkana. Ak obväz existuje skôr ako po odstránení obličky, ale dochádza k renálnym cievam, je možné pomocou dlhých koncov ligatúry tieto cievy uviaznuť.

Ak po rozrezaní pólu napriek pridržiavaniu tlaku na penové gélové vložky dôjde k krvácaniu, je to pravdepodobne spôsobené poranením veľkej obličkovej tepny alebo obličkovej panvičky. Toto krvácanie je možné zastaviť priložením nových gélových penových vložiek na ranu, neobťažovaním pohybovať penovou podložkou pri zdvíhaní zvyšku, pretože väčšie cievy sú blízko pupka, a dlhším čakaním.

Krv v moči sa môže vrátiť až 2 dni po operácii. Ak je poškodená obličková panva alebo dôjde k veľkému krvácaniu z funkcie obličiek, zostanú stopy po pretrvávajúcej hematúrii. Potkany s pretrvávajúcou hematúriou po operácii musia byť usmrtené, pretože nie je možné zastaviť krvácanie. Ak sa pozoruje hematúria neskôr po operácii, ktorá sa môže vyskytnúť až 2 týždne po operácii, je potrebné potkana tiež usmrtiť, pretože v obličkovej panve sa zrazila krv, ktorá nakoniec upchala močovod a močový mechúr a spôsobila prekážku.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.