Aeróbna krvná kultúra (s vhodným antibiogramom) - Synevo
Všeobecné informácie
Krvná kultúra je jednou z najdôležitejších a najcitlivejších metód pre mikrobiologické laboratórium. Krv, ktorá je obvykle sterilná, izoluje a identifikuje baktériu alebo hubu v krvnej kultúre, má značný diagnostický význam 13 .
Bakterémia je prítomnosť baktérií v krvi zo septického ohniska alebo poškodenej sliznice v krvi. Bakteremický stav často nemá klinickú expresiu alebo je sprevádzaný iba zimnicou a horúčkou, ku ktorým možno pridať príznaky a príznaky stavu, ktorý spôsobil bakteremický výtok.
Septikémia je klinický termín, ktorý definuje dôležitú bakterémiu s nepravidelným, nepredvídateľným a závažným klinickým vývojom sprevádzaným zimnicou, nepravidelnou horúčkou, toxémiou, hypotenziou, vyčerpanosťou, polymorfnými a rôznymi vyrážkami, tkanivovými alebo viscerálnymi septickými metastázami. Závažnosť septického syndrómu ponecháva v pozadí príznaky primárneho infekčného ohniska, ktoré treba vždy hľadať 1 .
Zárodky zapojené do:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli a ďalšie enterobaktérie, koaguláza-negatívne stafylokoky (SCN), Pseudomonas spp., Streptococcus spp., Anaeróbne baktérie, kvasinky
Streptococcus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp
Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae
Podľa vstupnej brány:
Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae
Enterobaktérie, prísne anaeróbne baktérie, Enterococcus spp.
Prísne anaeróbne baktérie, E. coli, Enterococcus spp.
Infekcie a prekážky močových ciest
Enterobaktérie, Enterococcus spp.
Princíp krvnej kultúry
Krvná kultúra je kvalitatívny test na detekciu mikroorganizmov prítomných v krvi. Krv odobratá za prísnych podmienok asepsy sa vysieva do fľaše na kultiváciu krvi, ktorej zloženie podporuje rozvoj aeróbnych, anaeróbnych a mikroaerofilných zárodkov 11 .
Hlavné faktory obohacovania obsiahnuté v prostredí, ktoré podporujú vývoj zárodkov, sú:
- kombinácia peptonov, kazeínu a želatíny na príjem aminokyselín;
- kvasnicový extrakt na príjem vitamínov;
- hemín a NAD, ktoré umožňujú vývoj Haemophilus a podporujú rast živín vyžadujúcich zárodkov, ako sú Actinobacillus spp., Cardiobacterium spp., Eikenella spp. a ďalšie anaeróby;
- vitamín B6, nenahraditeľný prvok pri vývoji streptokoka s nedostatkom endokarditídy a stafylokoka;
- CO2 dôležitý prvok pre rast choroboplodných zárodkov druhov: Neisseria, Brucella, Haemophilus, Streptococcus, Campylobacter.
Rozmnožovanie baktérií však závisí aj od série faktorov nezávislých od kultivačných podmienok: hustota zárodkov v krvi, ich stupeň rozmnožovania, prítomnosť niektorých inhibičných látok v krvi.
Bakterémia a fungémia dospelých sa spravidla vyskytujú u malého počtu cirkulujúcich mikroorganizmov (medzi 1 - 30 CFU/ml krvi). U novorodencov, kojencov a malých detí koncentrácia presahuje 100 CFU/ml. Vo všeobecnosti existuje priamy proporčný vzťah medzi závažnosťou infekcie, prognózou a koncentráciou baktérií v krvi. .
Baktérie zachytené vo fľaši na kultiváciu krvi môžu byť:
- neporušené, voľné v plazme, vo fáze aktívneho rozmnožovania a budú sa naďalej rýchlo deliť v bujóne krvnej kultúry alebo v pokojovej fáze a začnú sa množiť na konci fázy latencie zodpovedajúcej adaptácii na výživné prostredie liekovky;
- viac alebo menej poškodené alebo maskované pôsobením systému protilátka-komplement, antibiotiká, polymorfonukleárna fagocytóza alebo monocyty a vyvinú sa po autolýze leukocytov, ak zostanú životaschopné;
- Baktérie v tvare L (nedostatok výživy), ktorých rast si vyžaduje prispôsobené prostredie (hypertonické a bohaté na rastové faktory) 12 .
Rast baktérií v krvnej kultúre je možné spomaliť alebo im zabrániť, ak sa v kultivačnom médiu nepoužíva antikoagulant, pretože hrozí riziko zachytenia mikroorganizmov vo fibrínovej zrazenine. Niektoré antikoagulanciá môžu byť súčasne toxické pre určité patogény, rovnako ako antibiotiká v krvi. Tieto prekážky je možné odstrániť použitím polyanetholsulfonátu sodného (SPS), netoxického antikoagulancia, ktoré podporuje množenie baktérií neutralizáciou baktericídnej aktivity ľudského séra a inhibíciou účinku antibiotík (streptomycín, kanamycín, gentamicín, polymyxín B). SPS môže mať inhibičnú úlohu na niektoré kmene Peptostreptococcus, Neisseria, účinok neutralizovaný prítomnosťou želatíny v kultivačnom médiu.
Na trh sú dostupné poloautomatické alebo počítačové počítačové systémy na rýchlu detekciu baktérií v krvných kultúrach. Princípov, na ktorých sú tieto systémy založené, je viac. Uvádzame iba tie, ktoré používame v laboratóriu Synevo: priama detekcia produkcie CO2 pomocou:
-sériové skenovanie vzoriek plynov pochádzajúcich z bakteriálneho rastu v liekovke s krvnou kultúrou, ako v systéme BACTEC (BACTEC 9050);
-nútenie kultivačnej tekutiny (pod uvoľneným tlakom CO2), aby prešla do signálneho oddelenia, odkiaľ ju možno mikroskopicky a subkultivovať, ako je to v OXOIDOVOM SIGNÁLNOM SYSTÉME 9 .
Odporúčania pre určenie
Vykonáva sa na indikáciu lekára v určitých klinických situáciách, ako sú:
• všetky prípady horúčky nešpecifikovaného pôvodu, najmä ak sú sprevádzané klinickými príznakmi naznačujúcimi infekciu;
• pacienti s akútnou endokarditídou;
• syndróm naznačujúci systémovú infekciu špecifickými zárodkami (enterická horúčka, brucelóza, leptospiróza);
• závažné lokalizované infekcie (meningitída, zápal pľúc, vnútrobrušné hnisanie).
Krvná kultúra je tiež motivovaná:
• pacienti so zníženou imunitou (rakovina, drogovo závislí);
• pacient, ktorý je vystavený lekárskej agresii (katéter, dialýza alebo chirurgický zákrok) a má horúčkovitý stav;
• v určitých konkrétnych situáciách (tehotná žena, srdcový pacient, diabetik, s renálnou insuficienciou, hepatálnou insuficienciou), keď má pacient horúčku neurčeného pôvodu 8 .
Príprava pacienta
Odber vzoriek sa vykonáva pred antimikrobiálnou liečbou podľa prediktívneho vývoja febrilnej krivky alebo podľa toho, ako pacient signalizuje výskyt zimnice. Ak to nie je možné, krv sa odoberie bezprostredne pred podaním novej dávky antibiotika. Je indikované odobrať tri prerušované vzorky do 24 hodín; v prípade núdze je rytmus v intervale 30 - 60 minút 6 .
Odobratý exemplár - venózna krv, najlepšie nalačno (nalačno), hyperlipémia môže zabrániť dôkazu množenia baktérií v tekutom prostredí.
Oblasťou voľby pre punkciu sú žilky lakťovej obálky. Postup odberu vzorky rešpektuje normy aseptiky a antisepsy potrebné na to, aby sa zabránilo kontaminácii vzorky baktériami usadenými v kožnej flóre. Po odbere krvi sa 10 ml vzorky krvi odobratej v injekčnej striekačke vloží do nádoby so kultivačným médiom Signal tak, že sa za prísnych aseptických podmienok prepichne jej gumový uzáver. Fľaša sa jemne pretrepáva, aby sa homogenizovala v hmote média. Pre systém BACTEC sa odber vykonáva v nádobe na kultiváciu krvi na princípe vákuovo uzavretých systémov.
Vzorka je označená a prepravená čo najskôr od odberu do laboratória pri teplotách čo najbližších k 37 ° C (izotermická nádoba) 8 .
Potrebné materiály - 10 ml sterilná striekačka; fľaštička s kultivačným médiom Signál 8; injekčná liekovka s kultivačným médiom (BACTEC PLUS AEROBIC/F a PLUS ANAEROBIC/F 4; 10; 14, BACTEC PÈDS PLUS ™/F 5 vhodná pre pediatrické vzorky a malé objemy krvi) pre systém BACTEC.
Zozbierané množstvo - dospelý: 10 ml; dieťa: 3 - 5 ml (signál) a medzi 3 - 10 ml pre dospelých a 1 - 3 ml u dieťaťa (BACTEC) 8 .
Príčiny odmietnutia dôkazov
• nesprávne odobraté vzorky (neboli dodržané pravidlá antisepsy);
• nesprávna preprava 8 .
Vyžaduje sa spracovaniez po zbere - Signálny systém: je pripojená expanzná komora dodávaná v tej istej súprave. Inkubujte pri 37 ° C. Inkubačný čas na termostate a nasledujúcej vzorke je v priemere 7 dní. Predĺžená inkubácia je nutná u pacientov so subakútnou endokarditídou, vo vzorkách odobratých pri liečbe antibiotikami (až 14 dní) alebo pri sledovaní náročných mikroorganizmov 8 .
Systém BACTEC: naskenujte čiarový kód na fľaši do čítačky čiarových kódov a vložte fľašu do označenej polohy. Akonáhle sú dvere zatvorené, proces sa spustí automaticky. Prístroj má kapacitu 50 fliaš. Neustále sleduje injekčné liekovky s krvnou kultúrou inkubované pri 35 ° C. Injekčné liekovky sa nepretržite pretrepávajú, aby sa podporil rast baktérií. Pozitívne liekovky sú signalizované zvukovo a vizuálne. Systém automaticky vykonáva kontrolu kvality každých 10 minút. Integrovaný softvér spravuje vzorové údaje 2 .
Pracovná metóda
A. pre súpravu Signal-Oxoid; skladá sa z:
a) nádoba na signálne médium; zloženie tohto média umožňuje vývoj aeróbnych, anaeróbnych a mikroaerofilných klíčkov, čo spôsobuje zvýšenie tlaku detegovaného indikátorom rastu prispôsobeným fľaši (expanzná komora);
b) environmentálna expanzná komora; v prípade množenia baktérií a zvýšenia tlaku časť zmesi krv/bujón prechádza do tejto komory a indikuje bakteriálnu aktivitu (pozitívna kultúra krvi) 4 .
Na vykonanie testov sa používa klasická metóda:
• Makroskopické - vizuálne - vyšetrenie fľaštičiek na kultiváciu krvi dvakrát denne s cieľom zistiť príznaky rastu baktérií. Vzhľad injekčnej liekovky môže byť zameraný na príslušnú baktériu, napríklad:
a) zákal - aeróbne gramnegatívne bacily, Staphylococcus spp., Bacteroides spp .;
b) hemolýza - Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Lysteria spp., Clostridium spp., Bacillus spp .;
c) výroba plynu - aeróbne a anaeróbne gramnegatívne bacily;
d) zrazeniny - Staphylococcus aureus.
• Mikroskopické vyšetrenie čerstvého prípravku a Gramovo zafarbeného náteru z fľaštičky s krvnou kultúrou.
Poznámka: neustále miešanie nádobiek počas prvých 24 hodín inkubácie zlepšuje rast drvivej väčšiny aeróbnych baktérií 9; 15 .
Interpretácia kultúr v signálnom systéme
Absencia rastu - prostredie v nádobe Signal zostáva čisté a neprechádza cez zelené puzdro expanznej komory. Počas prvých 6 - 12 hodín inkubácie je možné pripraviť slepé subkultúry (naočkovanie na čokoládovom agare v atmosfére CO2 pri 35 ° C ďalších 48 hodín alebo v tyazlykolovanom vývare s resazurínom) a škvrny, ktoré sa zafarbia podle Grama (mikroskopické vyšetření).
Kontajnery s neprítomnosťou budú znovu inkubované a ďalej monitorované.
Pozitívna krvná kultúra - ak v krvi, ktorá sa má skúmať, boli zárodky, ktoré sa množili v kultivačnom médiu (pozitívna krvná kultúra), prostredie prejde do expanznej komory a vystúpi nad jej zelený rukáv.
B. Pre systém BACTEC je princíp fungovania nasledovný:
Mikroorganizmy vo fľaštičke uvoľňujú prostredníctvom metabolickej aktivity CO2 a fľaštičky obsahujúce aktivačný marker, ktorý sa pri kontakte s CO2 stane fluorescenčným, detekujú jeho prítomnosť. Fotodetektor fotoaparátu meria úroveň fluorescencie a odosiela údaje do počítača. Meranie je systémom interpretované podľa vopred naprogramovaných parametrov pozitivity. Počítač identifikuje pozitívnu injekčnú liekovku, ktorá je zvukovo a vizuálne signalizovaná žiarovkou. Grafická poloha pozitívne detegovanej injekčnej liekovky sa objaví na obrazovke prístroja.
Ako plne automatický systém sú liekovky monitorované každých 10 minút, čo umožňuje okamžitú detekciu pozitívnych liekoviek .
Monitorovací protokol je 7 dní - vývoj mikroorganizmov však možno zistiť po 8 hodinách 2; 4; 10; 14 .
C. Pozitívne krvné kultúry sa spracovávajú takto:
Signálny systém: Z dolnej oblasti expanznej komory sa odoberá malé množstvo média. Prístup do expanznej komory je umožnený jej hornou časťou, sterilným manévrom. Tento manéver nemôže kontaminovať obsah signálneho kontajnera.
Systém BACTEC: cez ihlu pripevnenú k fľaši sa odoberie také množstvo média, z ktorého sa urobia škvrny a vysejú sa na kultivačné médium 2 .
Vzorkované médium sa používa na:
a) nanášanie náterov na mikroskopické podložné sklíčka; skúmajú sa po Gramovom zafarbení. Vo vzťahu k výsledku odpočtov sa robia opakovania.
b) transplantácia na pevné a kvapalné médium v závislosti na mikroskopicky dokázaných baktériách: agarová krv/kolumbijská krv, agarová čokoláda, Levine/MacConkey, Sabouraud s chloramfenikol, tioglykolátový vývar s resazurínom.
c) doštičky sa inkubujú, v závislosti na mikroskopicky znázornenej baktérii, pri teplote 35 ° C - 37 ° C za aeróbnych podmienok, v atmosfére s 5-7% CO2 alebo v anaeróbóze (redukčná zmes GasPack +) po dobu 48 - 72 hodín. Skúmajú sa izolované kolónie.
d) testy potrebné na identifikáciu: ID katalázy, stafylokoková identifikačná súprava, streptokoková identifikačná súprava, disky Optokin, faktory X, V a XV, polytropné médiá pre enterobaktérie, oxidázová reakcia, testy API (API 20E, API 20NE, API NH atď.) testy na identifikáciu kvasiniek. Identifikáciu je možné vykonať tiež automaticky v systéme Vitek.
e) testovanie citlivosti na antibiotiká alebo antimykotiká difuzimetrickou alebo automatickou metódou na Viteku 9 .
D. Uverejnenie výsledkov
a) čiastočný výsledok podľa Gramovho zafarbeného náteru - je zaznamenaný a oznámený telefonicky;
b) konečný výsledok po izolácii, identifikácii baktérie a účinnosti antibiogramu alebo antimykotika.
Interpretácia konečného výsledku sa robí podľa klinického kontextu a počtu pozitívnych injekčných liekoviek vo vzťahu k odobratým 9 .
• niekoľko pozitívnych krvných kultúr s patogénnym zárodkom;
• niekoľko pozitívnych krvných kultúr so spoločným komenzálnym zárodkom v určitom klinickom kontexte;
• 1 pozitívna krvná kultúra so známymi patogénnymi zárodkami (Salmonella spp);
• 1 pozitívna krvná kultúra s potenciálne patogénnymi zárodkami v evokujúcom klinickom kontexte, ako sú: Streptococcus pneumoniae pri zápale pľúc, enterobaktérie pri infekciách močových ciest, koaguláza-negatívny stafylokok pri infekciách katétrom.
• 1 pozitívna krvná kultúra s komenzálnym zárodkom bez klinického kontextu: superinfekcia koaguláza-negatívnym stafylokokom, korynebaktériami, nezoskupiteľným streptokokom;
• pri depresívnom imunitnom poli sa berú do úvahy aj tieto baktérie;
• na normálnom imunitnom poli sa krvná kultúra opakuje.
• vzorka bola odobratá po liečbe antibiotikami;
• zber bol vykonaný neskoro počas choroby (objavujú sa protilátky);
• nedostatočné množstvo odobratej krvi;
• príliš krátky čas na pozorovanie;
• Nesprávne zvolené kultivačné médium.
Pozitívne krvné kultúry pre niekoľko bakteriálnych druhov
Ak bolo v jednej injekčnej liekovke alebo z rôznych injekčných liekoviek toho istého pacienta izolovaných niekoľko bakteriálnych druhov, musia byť pozorované v týchto situáciách:
• katéter udržiavaný dlho.
Izolované bakteriálne druhy v závislosti od vegetačného obdobia
• v prvých 1-2 dňoch rastú: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp, enterobaktérie;
• po 3 dňoch rastu: nefermentujúce gramnegatívne bacily, anaeróbne baktérie;
• za 4-5 dní: Haemophilus spp a koaguláza-negatívny stafylokok;
• každých 6-7 dní: druh Candida;
• o 9 dní: korynebaktérie 9 .
Limity a interferencie
• antimikrobiálna liečba použitá pred odberom vzoriek;
• kontaminácia krvi exogénnou flórou;
• nedostatočné množstvo odobratej krvi;
• frekvencia a čas nesprávne stanovenej úrody;
• nesprávne zvolené inkubačné a transplantačné prostredie;
• nevhodný inkubačný čas 1; 6; 12 .
1. Akiyama H., Kanzaki H., Tada J., Arata J. Koaguláza-negatívne stafylokoky izolované z rôznych kožných lézií. In D Dermatol, 25: 563-8. 1998. Typ odkazu: Denník (plný).
2. Becton Dickinson and Co., Bactec 9050. Systémy pre mikrobiológiu Becton Dickinson, Sparks, Maryland 21152 USA, 1997
3. Dumitru Buiuc. Krvná kultúra v diagnostike infekcie. V pojednaní o klinickej mikrobiológii. Dumitru Buiuc, Marian Negut, lekárske vydavateľstvo, Rumunsko, 2. vyd. 2008, 165-182.
4. Goldenbaum P., Stafford E., Talbot B. Laboratórna štúdia neutralizácie antimikrobiálnych látok kultivačným médiom obsahujúcim živicu, šiesty európsky kongres klinickej mikrobiológie a infekčných chorôb, 1993, 28-31.
5. Hardy L., Crowther L., Goldenbaum P., Beaty S . Šiesty európsky kongres klinickej mikrobiológie a infekčných chorôb, 1993, 28-31.
6. Joseph M.Civetta, Robert W. Taylor, Robert R. Kirby. Intenzívna starostlivosť. In Lippincott Raven vyd. 1997; 28: 405-412.
7. Koontz FP., Flint KK., Reynolds JK., Allen S. Multicenter Comparison of High Volume (10ml) nr BACTEC Plus and the Standard (5ml) nr. Systém BACTEC. In Diagn. Microbiol. Infikovať. Dis., 1991, 14: 111-8.
8. Kumar P.J., Clark M.L. In Clinical Medicine. Bailliere Tindall, UK, 2. vyd. 1990, 710-720.
9. Laboratórium Synevo. Konkrétne odkazy na použitú technológiu spracovania 2010. Typ odkazu: Katalóg.
10. Levievre H., Gimenez M., Vandenesch F. a kol. Multicentrické klinické porovnanie fliaš obsahujúcich živicu so štandardnými aeróbnymi a anaeróbnymi fľašami na kultiváciu mikroorganizmov z krvi. V Eur.J. Clin. Microbiol. Infect.Dis., 1997, 16: 669-674.
11. Loulergue J., Avril J.L., Omwanga D. Hemocultures. In Štúdium patologických produktov. Maury- Imprimeur S.A. vyd. 1987, 41-45.
12. Philippona A., Paul C., Nevot P. Hemoculture. In Rev.Prat, 33: 1929-38. 1983. Typ odkazu: Denník (plný)
13. Reimer L.G, Wilson M.L., Weinstein M.P. Aktualizované informácie o zisťovaní bakteriémie a fungémie. V Clin. Microbiol. Rev., 10: 445-465. 1997. Typ odkazu: Denník (plný).
14. Rohner P., Pepey Beatrice, Auckenthaler R., Výhoda kombinácie živice s lytickým médiom BACTEC pre krvnú kultúru. V J. Clin. Microbiol., 1997, 35 (10): 2634-8