Akútna mozgová trauma u myší nasledovaná pozdĺžnym dvojfotónovým zobrazovacím protokolom (preložené do
Zhrnutie
Akútna mozgová trauma je vážne zranenie, ktoré dodnes nebolo adekvátne liečené. Multipotónová mikroskopia umožňuje pozdĺžne štúdium procesu vývoja akútnej traumy mozgu a skúmanie terapeutických stratégií u hlodavcov. V tomto protokole sú demonštrované dva modely akútnej mozgovej traumy študované pomocou in vivo dvojfotónového zobrazovania mozgu.
Abstrakt
Úvod
Akútne poranenie mozgu je významným problémom verejného zdravia s vysokým výskytom zranení pri dopravných nehodách, pádoch alebo lúpežiach a vysokou prevalenciou chronického postihnutia. Terapeutické prístupy k liečbe poranení mozgu zostávajú úplne symptomatické, čo obmedzuje účinnosť predklinickej, chirurgickej a kritickej starostlivosti. To robí sociálne a ekonomické účinky poškodenia mozgu obzvlášť závažným. Z rôznych dôvodov väčšina klinických štúdií nedokázala zlepšenie zotavenia po poškodení mozgu pomocou nových terapeutických prístupov.
Zvieracie modely sú rozhodujúce pre vývoj nových terapeutických stratégií pre fázu, v ktorej sa predpokladá účinnosť lieku u pacientov s poranením mozgu. V súčasnosti existuje niekoľko zavedených zvieracích modelov poranení hlavy, medzi ktoré patrí kontrolovaný kortikálny náraz, poranenie nárazom tekutiny 2, dynamická kortikálna deformácia 3, pokles hmotnosti 4 a poranenia fotografie. Na štúdium určitých morfologických, molekulárnych a behaviorálnych aspektov patológie súvisiacej s úrazom hlavy sa použilo množstvo experimentálnych modelov. Avšak ani jeden zvierací model nie je úplne úspešný pri validácii nových terapeutických stratégií. Na vyhodnotenie zložitých patologických procesov je nevyhnutný vývoj spoľahlivých, reprodukovateľných a kontrolovaných zvieracích modelov poranenia mozgu.
Tu navrhujeme študovať metódu stereotaktického pichania injekčnou ihlou, ktorú je možné kombinovať so súčasnou aplikáciou lokálnych liekov, ako pokročilý model lokálneho poškodenia mozgu a ako nástroj na štúdium patofyziologických následkov akútnej traumy v mozgu cicavcov in vivo.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
Všetky tu uvedené postupy sa uskutočňovali v súlade s miestnymi pokynmi pre starostlivosť o zvieratá (Fínsky zákon o pokusoch na zvieratách 62/2006). Zvierací preukaz (ESAVI/2857/04.10.03/2012) bol získaný od miestneho úradu (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Dospelé myši vo veku 1 - 3 mesiace s hmotnosťou 24 - 38 g boli držané v jednotlivých klietkach v certifikovanom univerzitnom zariadení pre zvieratá a boli im podľa potreby podávané potraviny a voda.
1. Zobrazovanie poranení mozgu oknom mozgu
2. Zobrazenie poranenia mozgu cez stenčenú lebku
Vytvorte priemer 0,5 až 1,5 mm. Počas vŕtania odstráňte úlomky kostí stlačeným vzduchom. Vŕtanie vykonávajte prerušovane počas riedenia, aby ste predišli treniu. Vrták ochladte roztokom na izbovú teplotu a na zriedenú oblasť pravidelne nanášajte tlmivý roztok, aby absorboval teplo.
POZNÁMKA: Aby ste zabránili poškodeniu kôry, nevŕtajte veľké plochy (> 1,5 mm), okrem tenkej vrstvy (je potrebné predplatné. Odporúčajte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
1) chronické okno mozgu a 2) stenčenie lebky na posttraumatické zobrazenie mozgu u transgénnych myší: Optimalizovali sme dva operačné procesy. Schematické znázornenie skúmaných produktov je v Obr zobrazené. Traumatické vpichovanie cez oceľovú ihlu s vonkajším priemerom 0,3 mm (30 G) pri vrtnej jamke (Obrázok 1A) rozčúlený. Úspešná príprava okna lebky umožňuje snímanie v hĺbkach až 650 µm pod povrchom pia (Obrázok 1B), zatiaľ čo zriedenie lebky má tendenciu mať hranicu asi 300 µm (1C) uložte, ako pri 3D rekonštrukcii, Thy1-YFP-odolné H myšie kortikálne pyramídové bunky.
Výsledkom vpichovej traumy je eliminácia dendritov a deštrukcia kapilárnych sietí v kontrolovanom objeme mozgovej kôry. Počas prvých dvoch dní sa oblasť lézie zväčšila a traumou vyvolané dendritické pľuzgiere a tvorba dendritických retrakčných žiaroviek v periléznych oblastiach, ako je indikované pomocou in vivo multiphotónovej mikroskopie (Obr. 2) pozorované.
Ihneď po poranení sme uskutočnili aktiváciu a migráciu mikroskopických myší CX3CR1-EGFP pomocou lebky Forst (Obrázok 3A). Zobrazovanie SHG ponúka cenný nástroj na určenie miesta poranenia (3B) ohraničiť. Molekuly extracelulárnej matrice, ktoré produkujú signály SHG, sú vysoko obohatené v mozgovom parenchýme pri úraze. Najskôr sa vyvolajú jemné mikroprocesy, potom bunky mikroglie migrujú na hranicu miesta poranenia (Obrázok 3A).
Na vyhodnotenie možných poranení vyvolaných zavedením tenkej sklenenej pipety a dodaním farbiva uskutočňujeme in vivo experimenty s dvojfotónovou mikroskopiou s mikroinjekciou sulforodamínom 101 u myší Thy1-YFP-H bez poškodenia mozgu. V Obr Zobrazené reprezentatívne obrázky ukazujú miesto mikroinjekcie 3 hodiny po injekcii. Stopa zavedenia pipety do mozgových blán pomocou SHG (4A) rozpoznať vizualizované. Astrocyty so sulforodamínom 101 injekčne (Obr. 4B) zavedený označený. Dendrity YFP nevykazujú žiadne morfologické príznaky poškodenia, ako sú pľuzgiere alebo lámanie žiaroviek pod promótorom Thy1. (Obrázok 4 C) demonštrovať.
Obrázok 4. Štúdia zaťaženia tkaniva pripraveného injekčným roztokom cez sklenenú mikropipetu. A. Jedna stopa (znázornená prerušovanou čiarou) v SHG vizualizácii mozgových blán 3 hodiny po injekcii. B. Astrocyty označené sulforodamínom zavedené injekciou. C. Dendrity exprimujú YFP pod promótormi Thy1. D. Kombinovaný obrázok A. (SHG - šedá), B. (Astrocyty - červené), C. (neurálne dendrity - žlté).
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Diskusia
Trauma mozgu je náhla, nepredvídateľná udalosť. Tu popisujeme zvierací model, ktorý reprodukuje spektrum krvi u ľudských pacientov po poškodení mozgu, ako je neurodegenerácia, eliminácia dendritov, edém mozgu, gliové jazvy, krvácanie do mozgovej kôry spojené s fokálnym subarachnoidálnym krvácaním a zvýšená permeabilita pozorovaných patologických zmien. - Mozgová bariéra. Za účelom vyšetrenia primárnej a sekundárnej patogenézy, ako aj zotavenia po traume, bol tento model poranenia kombinovaný s pozdĺžnou in vivo vizualizáciou jemných nervových a gliových štruktúr. Boli použité transgénne myšie línie, ktoré exprimujú fluorescenčné proteíny mikroglie (CX3CR1-EGFP) 9 v neurónoch (Thy1-YFP-H) 7, astrocytoch (GFAP-EGFP) 8 alebo. Ďalej sme použili zobrazovanie druhej harmonickej generácie (SHG) a zaťaženie astrocytov liekom Sulfarhodamin 101 10.
Tu opísaný model rekapituluje penetračný typ poranenia mozgu. Preto je obmedzením súčasného modelu to, že neposkytuje informácie o mechanizmoch uzavretého poranenia hlavy. V poslednej dobe Schwert a spoluautori uvádzali výsledky multipotónového zobrazovania správania buniek v perikontúznej kôre 6. S prihliadnutím na to, že uzavreté poranenie hlavy je bežným medicínskym prípadom, je metodologický prístup, ktorý autori uvádzajú, veľmi sľubný pre tradičné výskumné metódy v oblasti účinkov na mozog. Doplnok Trauma 11.
Na štúdium správania buniek v posttraumatických podmienkach v živých mozgoch sme použili preparáty chronického lebky 12 aj preparáty 13 na zriedenie lebky. Obidve metódy majú určité výhody a obmedzenia. Chronické okno mozgu teda poskytuje lepšie rozlíšenie, vylepšenú optickú hĺbku prieniku do mozgového tkaniva a pohodlie pre viac zobrazovacích jednotiek. Naopak, je menej pravdepodobné, že spôsobí zápal v zobrazovacom mieste zriedenia lebky, a čo je dôležitejšie, umožňuje opakovanú aplikáciu liekov a farbív. Niektoré príklady farmakologických látok, ktoré sa majú použiť v tomto type experimentu, sú uvedené v stôl 1 špecifikované.
Tabuľka 1. Farmakologické látky a farbivá na injekciu v modeli poranenia kortikálnym poranením.
Širokú škálu biochemických dejov, ktoré sú veľmi dôležité za fyziologických a patologických podmienok, je možné skúmať chemickými inhibítormi, fluorescenčnými indikátormi a mutovaným proteínom zavedeným prostredníctvom vírusových konštruktov. Pre tieto štúdie môžu byť veľmi dôležité výhody výberu konkrétnych časových okien, ktoré poskytuje príprava na zriedenie lebky.
V tejto štúdii sme vygenerovali druhý harmonický signál na vymedzenie miesta poranenia. Alternatívne môžu byť hranice miesta poranenia indikované slabo rozptýleným fluorescenčným farbivom, napríklad fluorescenčným konjugátom dextránu s vysokou molekulovou hmotnosťou (2 milióny daltonov).
Schaffer a kolegovia 14 nedávno použili chronické okno na opätovné otvorenie lebky na opätovné dodanie fluorescenčných farbív do myšej kôry. Je pravdepodobné, že opätovné otvorenie okna lebky môže nepriaznivo ovplyvniť priehľadnosť mozgového tkaniva. Okrem toho je ťažké predpovedať časový priebeh zápalu vyvolaného spätným vychytávaním, ktorý môže ovplyvniť opätovný rast spojivového tkaniva.
Hlavnou výhodou výroby zriedenej lebky je schopnosť dodávať terapeutické zlúčeniny (a ďalšie materiály vyžadujúce miestnu injekciu do mozgového tkaniva) viackrát počas progresie traumy, bez komplikácií artefaktov (napr. Bez obnovenia mozgového okna).
V prípadoch, ktoré nevyžadujú priamy prístup k poranenej oblasti, odporúčame zriedenú oblasť lebky zriediť skleneným krycím sklíčkom, ako je popísané v dokumente Paper and Steel o leštenej lebke, ktorý vypracoval Kleinfeld a jeho kolegovia 15. Toto je možné dosiahnuť pomocou nasledujúce voliteľné postupy. Na zriedenú oblasť lebky dajte malú kvapku agarózy (1,5%), počkajte, kým zgelovatie, odstráňte všetku nepotrebnú agarózu, takže ju nechajte len na mieste poranenia. Agaróza by mala chrániť miesto poranenia pred vonkajšími vplyvmi. Vysušenú vrchnú časť hlavy osušte stlačeným vzduchom. Nechajte malé množstvo polyakrylového lepidla na malom kúsku krycieho sklíčka # 0 a položte ho na zriedenú oblasť lebky. Lepidlo zabraňuje opätovnému rastu polyakrylovej kosti a spojivového tkaniva, a tým udržuje zriedenú lebku zachovanú pod oknom.
Kombinácia týchto postupov umožňuje štúdium akútnych a chronických poúrazových procesov a dodáva lieky lokálne alebo systémovo a priamo monitoruje účinky liečby. Môže byť tiež užitočné použitie dvojitých alebo trojitých transgénnych myšacích línií, čiastočne seinders, na súčasné zobrazenie viacerých posttraumatických procesov, ako je zjazvenie gliových buniek a opätovný rast nervových vetiev. Očakávame, že naše modely akútneho poškodenia mozgu vyšetrené pomocou intravitálnej dvojfotónovej mikroskopie sa ukážu ako plodné pre testovanie kandidátnych liekov.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Zverejnenie
Autori nemajú čo prezradiť.
Poďakovanie
Sme hlboko vďační, že Dr. Frankovi Kirchhoffovi za poskytnutie myších kmeňov GFAP-EGFP a CX3CR1-EGFP. Práca bola podporená grantmi z Centra pre medzinárodnú mobilitu Fínska, Tekes, Fínskej vysokej školy pre neurovedy (FGSN) a Fínskej akadémie.