Apoptóza keratinocytov súvisí s infiltráciou lymfocytov cd8 a akumuláciou

predmetov

abstraktné

Imunopatomorfologické zafarbenie vzoriek tkaniva umožňuje mikroskopické hodnotenie morfologických detailov, fenotypov a prítomnosti aktivačných markerov v infiltrujúcich bunkách. Prítomnosť lymfocytov, hlavne CD8 +, v blízkosti epiteliálnych buniek kože1 a prítomnosť apoptózy jednej bunky svedčia o akútnej GVHD. 23 Oblasti nukleárnych organizérov (NOR) bazálnych buniek sú v kožných biopsiách silne zafarbené. Akútna akumulácia GVHD .4-NORs charakterizuje bunky v bunkovom cykle.5 Bolo to interpretované ako znak zvýšenej rýchlosti proliferácie kožných keratinocytov v akútnych léziách GVHD. Akumulácia NOR ukazuje, že bunky sú v bunkovom cykle, ale to nemusí byť dokončené úspešnou mitózou. Ak sa bunkové delenie nedá dokončiť, proces končí apoptózou

V predloženej práci sme skúmali vzťah medzi mierou infiltrácie lymfocytov a prítomnosťou Ki67 + a apoptotických buniek v kožných biopsiách získaných od pacientov s akútnou GVHD. Ďalej sa hodnotila pozitivita keratinocytov na PCNA, cyklín A a cyklus bunkového delenia 2 (cdc2). Táto komplexná analýza preukázala narušenie rastového cyklu keratinocytov u pacientov po BMT, čo pravdepodobne podporuje apoptotické procesy spojené s rozsahom lokálnej infiltrácie CD8 + bunkami.

Pacienti a metódy

Pacient

Osemnásť prípadov (10 dospelých a 8 detí) s chronickou myeloidnou leukémiou (n = 6), akútnou leukémiou a myelodysplastickým syndrómom (n = 7), aplastickou anémiou a Fanconiho anémiou (n = 5) bolo identifikovaných buď s BM (12 pacientov) alebo s PBPC (5 pacientov). Jeden pacient (CML) dostal PBPC od svojej matky (alternatívny transplantát darcu) (tabuľka 1).

Kondicionačný režim pozostával z busulfánu (BU) 4 mg/kg telesnej hmotnosti a cyklofosfamidu (CY) 50 mg/kg telesnej hmotnosti, podávaného 4 dni (celková dávka 16 mg/kg telesnej hmotnosti a 200 mg/kg telesnej hmotnosti BU alebo CY) pre osem pacientov s leukémiou so štandardným rizikom alebo BU 4 mg/kg telesnej hmotnosti počas 4 dní (celková dávka 16 mg/kg telesnej hmotnosti) a CY 60 mg/kg počas 2 dní (celková dávka 120 mg/kg telesnej hmotnosti), doplnené 5–15 mg/kg telesnej hmotnosti etopozidom v 2 Dni (celková dávka 10 - 30 mg/kg telesnej hmotnosti) alebo 250 mg/m 2 tiotepy za 3 dni (celková dávka 750 mg/m 2) u troch alebo dvoch pacientov s nízkym rizikom. Prípady FA dostávali 5–15 mg/kg telesnej hmotnosti anti-tymocytového globulínu (ATG, Fresenius, Bad Homburg, Nemecko) po dobu 5 po sebe nasledujúcich dní (celková dávka 25–75 mg/kg telesnej hmotnosti) a CY 20 mg/kg telesnej hmotnosti, podávaných v 4 dni (celková dávka 80 mg/kg telesnej hmotnosti). Pacienti s SAA dostávali CY v dávke 50 mg/kg telesnej hmotnosti za 4 dni (celková dávka 200 mg/kg telesnej hmotnosti) a 5 mg/kg telesnej hmotnosti ATG za 5 dní (celková dávka 25 mg/kg telesnej hmotnosti) (tabuľka 1).

Akútna profylaxia GVHD zahŕňala cyklosporín A (CsA) na zníženie sérových hladín medzi 100 a 200 ng/ml a metotrexát (MTX) v dávke 10 mg/m 2 alebo 5 mg/m 2 (iba pacienti s SAA) v dňoch + Dosah 1, +3, +6 a +11. Liečba MTX bola prerušená v dvoch prípadoch kvôli toxicite na sliznicu alebo pečeň. Toxicita sa hodnotila podľa štandardných kritérií WHO. Akútne príznaky GVHD viedli k zahájeniu liečby prednizónom od dávky 2 mg/kg telesnej hmotnosti, ktorá sa zvyšovala v intervaloch 2 dní, ak sa neobjavila žiadna reakcia.

Ako kontroly pre štúdie markerov rastového cyklu sa použili biopsie normálnej kože od štyroch prípadov (vo veku 15 až 49 rokov), ktorí podstúpili operáciu hrudníka kvôli nezhubným a nezápalovým ochoreniam. Značenie lymfatických uzlín s metastatickými léziami dokumentovalo schopnosť protilátok cyklínu A, cdc2 a Ki67 detekovať bunky v bunkovom cykle (nezobrazené).

Metódy

Kožné biopsie sa odoberali pri prvých príznakoch kožných lézií pred alebo nasledujúci deň (s výnimkou jedného prípadu) po podaní prednizónu (tabuľka 1).

Rezy zafarbené H + E sa hodnotili podľa publikovaných kritérií pre akútne GVHD7 a apoptotické lézie.8 Infiltrácia mononukleárnych buniek sa hodnotila nasledovne: menej ako päť buniek v klastri, stupeň 0; 6–20 buniek v zhluku, stupeň 1; 21 až 50 buniek v klastri, stupeň 2; Fokus obsahuje viac ako 50 buniek v klastri, stupeň 3, a viac ako jedno zameranie v tkanive, stupeň 4.

Štatistická analýza

Na štatistické vyhodnotenie výsledkov sa použili Mann-Whitneyov U test, Fisherov presný test a Studentov t test pre spárované vzorky.

Výsledky

apoptóza

Sekvenčné biopsie kože (zmrazené rezy) od pacienta s akútnou GVHD rezistentnou na steroidy (UPN 88). Počet epitelových buniek Ki67 + a apoptotických buniek sa zvýšil, keď akútny GVHD úplne rástol (+17 dní oproti +31 dní po BMT), a v konečnom štádiu opäť klesol. Akútna GVHD (+45 dní po BMT) (pôvodné zväčšenie × 400) .

keratinocytov

Akútne parafínové blokové rezy stupňa GVHD III. Stupňa farbia proteíny spojené s bunkovým cyklom a apoptotické bunky. Upozorňujeme na akumuláciu antigénu Ki67, PCNA a cyklínu A vo zväčšených bunkových jadrách, nedostatok buniek pozitívnych na Cdc2 a množstvo apoptotických buniek v základnej vrstve epitelu (pôvodné zväčšenie × 400).

Spočítali sa Ki67 pozitívne bunky a vyhodnotil sa rozsah zafarbenia. Frakcia buniek Ki67 + v bazálnej vrstve epidermy bola podobná v obidvoch vzorkách s apoptotickými bunkami aj bez nich (stredné hodnoty: 0,25 vs. 0,2). Avšak farbenie Ki67 + bolo oveľa silnejšie v tkanivových rezoch s prítomnými apoptotickými bunkami. Bunkové jadrá boli väčšie a silnejšie označené Ki67 MoAb ako biopsie bez apoptózy (obrázky 1 a 2). Tento obrázok bol viditeľný v siedmich z deviatich vzoriek s apoptotickými bunkami a iba v jednom z deviatich v tkanivových rezoch bez apoptózy (P = 0,008) (tabuľka 4).

Sekvenčné biopsie kože ukázali, že ako postupoval akútny GVHD, tak počet buniek Ki67 + aj apoptotických buniek sa zvyšoval. Bunky Ki67 + v pokročilej akútnej GVHD sa ohniskovo zoskupili. V akútnom konečnom štádiu GVHD sa Ki67 + aj apoptotické bunky znížili so znížením počtu epidermálnych buniek (obrázok 1). Sfarbenie PCNA sledovalo vzorec Ki67, ktorý bol o niečo menší v biopsiách s toxickými léziami na rozdiel od akútnej GVHD kože (nie je znázornené).

Pacienti boli zoskupení podľa výsledkov farbenia TUNEL (tabuľka 1). Skupinu 1 tvorili pacienti s apoptotickými bunkami a skupina 2 pacientov bez apoptotických buniek v biopsii kože. Pacienti s apoptotickými bunkami v kožných biopsiách boli starší ako pacienti bez apoptotických buniek (priemer ± sem .: 24, 8 ± 3, 7 oproti 15, 2 ± 3, 4 roky; p = 0,042) a častejšie dostávali toxickejšiu úpravu, ku ktorým patril etopozid alebo tiotepa (4/9) oproti 1/9, NS) (tabuľka 1). Oba faktory mohli prispieť k závažným toxickým komplikáciám sliznice, ktoré sa vyskytovali častejšie v skupine 1 ako v skupine 2 (P = 0,013) (tabuľka 1). Všetci pacienti s pozitívnym sfarbením kože na apoptotické bunky (skupina 1) splnili histopatologické a klinické kritériá akútnej GVHD. Aj v akútnom štádiu GVHD boli pokročilejšie ako pacienti v skupine 2 (P = 0,015) (tabuľka 1).

Šesť akútnych GVHD, dve kožné biopsie s toxickými léziami a štyri kontrolné vzorky kože bolo možné vyšetriť na sfarbenie proteínu súvisiaceho s rastovým cyklom v parafínových blokových rezoch. Vo všetkých ôsmich vzorkách (bez ohľadu na to, či mali akútne GVHD alebo toxické lézie) bola frekvencia buniek pozitívnych na cyklín A vyššia ako frekvencia buniek pozitívnych na cdc2 (32% oproti 8%; P = 0,072) (2 ) na rozdiel od normálnej pokožky, ktorá bola charakterizovaná podobným podielom buniek pozitívnych na cyklín A a cdc2 (3). Prevalencia buniek pozitívnych na cyklín A oproti cdc2 pozitívnym bunkám sa pozorovala v biopsiách s akútnou GVHD bez ohľadu na výsledky farbenia TUNEL. Avšak akumulácia cyklínu A bola pozorovaná vo všetkých štyroch biopsiách s apoptotickými bunkami, ale nie v normálnej alebo chorej koži bez apoptotických buniek (osem biopsií) (2 a 3). Cyklický A vzor farbenia bol podobný ako v prípade Ki67. To isté sa pozorovalo pri cyklíne A, keď sa akumuloval proteín Ki67 (2).

apoptóza

Sekcie parafínovej blokády s normálnou pokožkou sa farbia, ako je opísané na obrázku 2. Je potrebné poznamenať, že prevalencia PCNA v porovnaní s bunkami Ki67 + je pozitívna, že bunky pozitívne na cyklín A a Cdc2 sú prítomné v rovnakých pomeroch a že horná epiteliálna vrstva je hnedastá (zafarbenie apoptotických buniek). Zväčšenie × 400).

diskusia

Počet apoptotických buniek bol nízky a boli pozorované u pacientov s výraznejšou toxicitou na sliznicu a/alebo kožu. Súviseli so závažnosťou akútnej GVHD a rozsahom infiltrácie lymfocytov do kože, ale nie s prítomnosťou lymfocytov v pokožke. Apoptóza je preto súčasťou obrazu plnohodnotnej akútnej GVHD, ktorá zahŕňa poškodenie tkaniva a infiltráciu lymfocytov (tabuľka 2).

Ukazuje sa, že poškodenie kože u pacientov po BMT je proces pozostávajúci z dvoch krokov. Genotoxická urážka spočiatku ovplyvňuje bunkový cyklus a vedie k defektu na hranici G2/M. Napriek relatívne vysokému podielu buniek, ktoré sú buď Ki67- (obrázok 2), alebo AgNOR-pozitívne, vedie to k nízkej mitotickej rýchlosti keratinocytov.4 Táto situácia spôsobuje, že bunky sú náchylné na apoptotickú smrť. Mechanizmus, ktorým sa konečný apoptický zásah dodáva do keratinocytov, nemožno z tejto štúdie odvodiť, je však pravdepodobné, že bude spojený s infiltráciou lymfocytov. Môže to byť skôr kvôli lokálnemu uvoľňovaniu zápalových cytokínov, ktoré môžu mať potenciál zastavenia rastu (napr. TNFα) 22, ale nie priamym útokom lymfocytov závislým od enzýmu. Granzym indukuje apoptotickú smrť a vyžaduje aktivitu cdc2 kinázy 19, ale zdá sa, že po BMT v pokožke chýba.