Beta-talasémia-genetické testovanie (HBB) - Synevo
Beta-talasémie sú skupinou chorôb s autozomálne recesívnym genetickým prenosom, ktorá sa vyznačuje nízkou rýchlosťou syntézy β reťazcov globínu.
Klaster β génov sa nachádza na chromozóme 11, rozkladá sa na dĺžke 50 kb a obsahuje v tomto poradí: gén epsilon (ε), 2 gény gama (nazývané G γ a A γ), pseudogén β (ψβ), a gén delta (δ) a gén β (nazývaný HBB) kódujúci p-globín 1. Každý gén má 3 sekvencie kódujúce proteíny (exóny) a 2 oblasti, ktoré zjavne nemajú žiadnu úlohu v syntéze proteínov (intróny = intervenujúce sekvencie), lemované 5 'a 3' sekvenciami, ktoré tiež nezasahujú do procesu translácie. Na 5 'konci každého génu je promótor, sekvencia potrebná na zahájenie transkripcie. Promótor β génu obsahuje 3 sekvencie: TATA box, CCATT box a duplikáty CACC motívov. Exóny aj intróny trpia fenoménom transkripcie DNA na mediálnu RNA; tento proces je riadený transkripčnými faktormi, ktoré sa viažu na promótory a riadiace prvky proti prúdu - zosilňovače - ktoré výrazne zvyšujú rýchlosť transkripcie. Gény pre β-globín sú teda pod vplyvom hlavného zosilňujúceho prvku, ktorý sa nazýva oblasť kontroly β-lokusu (β-CSF) (pozri obrázok) 1; 3 .
Fenomén prepisu zahrnuje nasledujúce kroky:
- skutočná transkripcia: výsledkom je RNA kópia génu, ktorá obsahuje komplementárne sekvencie pre exóny aj pre intróny;
- enkapsulácia a polyadenylácia (zakončenie + polyadenylácia): pripojenie špeciálnych nukleotidov na 5 'a 3' koniec RNA;
- zostrih: odstránenie intrónov z mRNA; sekvencie RNA zodpovedajúce exónom sú potom spolu „vrodené“ 3 .
Beta talasémia sa vyskytuje častejšie u populácií v oblasti Stredozemného mora, môžu však byť postihnuté aj iné etnické skupiny. Závažnosť chyby je premenlivá. Normálni ľudia majú 2 alely pre β-globín, takže β-talasémia sa môže vyskytovať v heterozygotnom alebo homozygotnom stave. Pretože s β-talasémiou je spojené veľké množstvo mutácií, sú možné aj prípady zloženej heterozygotnosti, ktoré sa vyskytujú, keď má človek 2 mutantné gény.
Sú opísané dve široké kategórie β-talasémie:
-β alebo talasémia (beta nulová talasémia): charakterizovaná absenciou expresie abnormálneho génu β alebo zriedkavejšie jeho deléciou; keď sa porucha objaví v homozygotnom stave (β o/β o), je úplne ovplyvnená syntéza β reťazcov a implicitne hemoglobínu A;
-β + talasémia (beta plus talasémia): charakterizovaná zníženou (ale absentujúcou) expresiou abnormálneho β génu; keď sa porucha objaví v homozygotnom stave, dôjde k určitej produkcii hemoglobínu Al; 5 .
Zložené heterozygoty pre β-talasémiu môžu mať 2 rôzne gény β o alebo β + alebo obidva gény β + a β 0 (β +/β o).
Klinický obraz je veľmi variabilný. Heterozygotný stav pre β-talasémiu, nazývaný tiež β-talasémia alebo malá β-talasémia, je vo väčšine prípadov klinicky asymptomatický stav. Homozygotný stav alebo zložená heterozygotnosť pre β-talasémiu zvyčajne vedie k závažnému klinickému fenotypu nazývanému β-talasémia veľká, pri ktorom sú postihnutí jedinci závislí od krvných transfúzií. Termín medziprodukt β-talasémia zahrnuje klinické stavy strednej závažnosti medzi malými a hlavnými formami; Postihnutí ľudia sú symptomatickí a môžu si občas vyžadovať krvné transfúzie, nie sú však potrebné na udržanie života 1 .
Genetické testovanie
V súčasnosti je známych viac ako 200 mutácií spojených s β-talasémiou, ktoré je možné detegovať rôznymi technikami PCR, hybridizáciou so syntetickými oligonukleotidmi alebo sekvenovaním. .
Vo väčšine prípadov ide o mutácie, ktoré sa vyskytujú v géne HBB alebo v jeho blízkosti (substitúcie jednotlivých nukleotidov, delécie alebo inzercie oligonukleotidov). V závislosti od postihnutej genetickej udalosti sú opísané tri typy mutácií:
-ovplyvnenie transkripcie p-globínu;
-ktorý ovplyvňuje spracovanie mRNA (spojovacie alebo polyadenylačné javy);
-ktoré produkujú abnormálny preklad mRNA (nezmysly alebo mutácie čítacieho rámca) 3 .
Malé percento prípadov je výsledkom veľkej delécie génu alebo kontrolných sekvencií umiestnených proti prúdu 1; 2 .
Pokiaľ ide o závažnosť indukovaného defektu, mutácie génu HBB spadajú do dvoch širokých kategórií:
Odporúčania pre mutačnú analýzu
-stanovenie prognózy z hľadiska klinického fenotypu (molekulárna diferenciácia hlavnej intermediárnej talasémie);
-sledovanie dopravcov vo vysoko rizikových rodinách;
-prenatálna diagnostika beta talasémie 5; 6 .
Odobratý exemplár - krv príde 4 .
Zberová nádoba - vacutainer obsahujúci EDTA ako antikoagulant 4 .
Zozbierané množstvo - toľko, koľko umožňuje vákuum 4
Dôvody zamietnutia skúsiť - použitie heparínu ako antikoagulancia; zrážané alebo hemolyzované vzorky 4 .
Vyskúšajte stabilitu - 7 dní pri 2 - 8 ° C 4 .
Metóda - kompletný radič HBB 4 .
Interpretácia výsledkov
Krajina s beta-talasémiou (heterozygotný stav)
Ľudia s β-talasémiou sú zvyčajne bez príznakov; je však možné, že v podmienkach hematopoetického stresu (tehotenstvo, sprievodné infekcie) sa prejavujú prejavy spojené s anémiou. Niektorí pacienti môžu mať splenomegáliu.
Hemogram ukazuje charakteristické zmeny v sérii erytrocytov: mierny pokles hodnoty hemoglobínu, zvýšený počet erytrocytov, nízke hodnoty indexov erytrocytov VEM a HEM, šírka distribúcie erytrocytov zvyčajne normálna. V priemere sa hematologické premenné líšia v krajinách β 0 a β +, aj keď sa môžu značne prekrývať. V prípadoch, keď existuje súbežná α-talasémia, sú hematologické abnormality menej výrazné.
Na nátere periférnej krvi môžete spolu s mikrocytózou vidieť hypochromiu, poikilocytózu, červené krvinky „na cieľ“, bazofilné punkcie. Vyšetrenie kostnej drene ukazuje zvýšenú bunkovosť v dôsledku hyperplázie erytroidov.
Diagnóza je založená na detekcii zvýšeného percenta HbA2 hemoglobínovou elektroforézou alebo chromatografickou technikou (HPLC). Asi jedna tretina až polovica pacientov sa spája so zvýšeným percentom HbF.
Podiel hemoglobínu A2 koreluje s typom mutácie beta-talasémie. Vo väčšine prípadov heterozygotnosti pre β 0 alebo ťažkú β + -talasémiu je teda zaregistrované percento 4 - 5% HbA2, zatiaľ čo pri ľahkých formách β + - talasémie je percento zvyčajne 3,6 - 4,2%. Vyššie percentuálne podiely sa vyskytujú v krajinách spojených s deléciou 5 'časti génu HBB, ako aj v prípade mutácií promótora alebo iniciačného kodónu.
Príčiny β-talasémie s normálnym HbA2
Existujú aj formy β-talasémie s normálnym percentom HbA2, ktoré sa nazývajú tichá β-talasémia. Napríklad v prípade mutácie C → G z polohy 6, 3 'na terminálnom kodóne sa zistí priemerné percento 2,4%.
Ak má osoba indexy erytrocytov naznačujúce beta-talasémiu, ale hladina HbA2 nie je zvýšená, je dôležité vylúčiť δβ-talasémiu, leporečnú hemoglobinopatiu a α-talasémiu. Môže existovať γδβ-talasémia, ale tento stav je veľmi zriedkavý. Niektorí pacienti s anémiou z nedostatku železa môžu mať atypické indexy erytrocytov; najmä deti môžu mať anémiu z nedostatku železa sprevádzanú zvýšeným počtom erytrocytov.
Nízka hladina feritínu naznačuje nedostatok železa, ale nevylučuje diagnózu beta-talasémie.
Mutácie HBB spojené s malými alebo chýbajúcimi hematologickými abnormalitami v heterozygotnom stave predstavujú dôležité diagnostické problémy; ich identifikácia je nevyhnutná, pretože môžu spôsobiť klinicky významný stav v homozygotných alebo heterozygotných zlúčeninách. Tieto typy mutácií možno rozdeliť do dvoch skupín:
-mutácie, ktoré spôsobujú „tichú talasémiu“ s indexmi erytrocytov a normálnym percentom HbA2;
-mutácie, ktoré spôsobujú „takmer tichú talasémiu“ s normálnymi HbA2 a zmenenými indexmi erytrocytov.
Tieto formy je možné zistiť iba genetickým testovaním. Niektoré mutácie, napríklad +1480 C → G v gréckej populácii, sú také mierne, že takmer vždy spôsobujú „tichú talasémiu“. Mutácie, ktoré sú najčastejšie zodpovedné za túto formu talasémie, sú -101 C → T a -92 C → T spojené s týmito priemernými hodnotami: VEM = 83,9 fL, HEM = 28,6 pg a HbA2 = 3,4%. „Takmer tichá talasémia“ je výsledkom malej skupiny mutácií, ako je CAP + 1 A → C v Indii a príležitostne IVS-6 T → C v Stredozemnom mori. Heterozygoti pre IVS-6 T → C vykazujú nasledujúce rozsahy hodnôt: VEM = 60-78 fL a HbA2 = 3,2-4-6%.
Nedostatok železa znižuje percento HbA2 u ľudí bez defektov v globíne aj u ľudí s beta-talasémiou. To nie je problém pre ľudí s genetickou abnormalitou sprevádzanou významným zvýšením HbA2, ale pre ľudí s miernymi mutáciami spojenými s miernym zvýšením nedostatku HbA2 železa maskuje krajinu beta-talasémie. Z tohto dôvodu sa odporúča, aby sa u pacientov s ťažkou alebo stredne závažnou anémiou z nedostatku železa najskôr odstránil nedostatok železa, potom sa má merať percento HbA2, ak pretrvávajú zmeny indexov erytrocytov. Výnimku z tohto odporúčania urobia tehotné pacientky, u ktorých by sa mala okamžite diagnostikovať beta-talasémia. V tejto situácii je potrebné partnera vyšetriť; ak sa zistí v krajine s beta-talasémiou, bude sa brať do úvahy genetické testovanie u tehotných žien s hraničnými hladinami HbA2.
Megaloblastická anémia môže tiež viesť k zníženiu hladín HbA2 a interferovať s diagnostikou β-talasémie.
Asociácia zmenených indexov erytrocytov s normálnou hladinou HbA2 môže tiež vyplynúť z koexistencie δ-talasémie s mutáciou β 0 alebo β +, ktorá indukuje vysoké percento HbA2 (nachádza sa u jašteríc a cyprusov). Knossos hemoglobín je tiež zodpovedný za niektoré prípady β-talasémie s normálnou hladinou HbA2.
Sprievodná prítomnosť miernej β-talasemickej mutácie (napríklad CAP + 1 A → C) a kmeňa α0-talasémie alebo homozygotný stav pre α +-talasémiu spôsobuje, že diagnóza sily β-talasémie je často vynechaná.
Krajina s Β-talasémiou s normálnymi indexmi erytrocytov a zvýšeným HbA2
Niektorí heterozygotní pacienti pre určité varianty miernej β-talasémie môžu mať zvýšené hladiny HbA2 v prítomnosti normálnych indexov erytrocytov; tento stav sa zistil u niektorých pacientov s mutáciou -101 C → T.
Okrem toho môže koexistencia α a β-talasémie viesť k normálnym indexom erytrocytov prostredníctvom vyváženejšej syntézy globínových reťazcov, ale so zvýšeným percentom HbA2. Táto zmena je obzvlášť častá u pacientov s deléciami dvoch génov α alebo s formou nedeléčnej α-talasémie.
Získané abnormality, ako sú tie, ktoré sú vyvolané ochorením pečene, môžu zvýšiť hodnoty indexu erytrocytov u pacientov s β-talasémiou.
Všetky tieto príklady ilustrujú zložitosť prípadov β-talasémie v jednotlivých krajinách a ťažkosti s ich identifikáciou, pričom genetické testovanie je niekedy jediným vyšetrením, ktoré môže potvrdiť diagnózu 1; 2 .
Aj keď väčšina ľudí s heterozygotnou mutáciou β-talasémie má klinicko-patologické príznaky opísané ako ľahká talasémia (zmenený hematologický obraz pri absencii klinických prejavov), u niektorých z nich sa vyvinie splenomegália, anémia, žltačka a žlčové kamene, čo je stav nazývaný β-talasémia. Fenotyp je podobný medziproduktu β-talasémie a je spojený s neúčinnou erytropoézou aj s hemolytickou zložkou. Charakteristická je prítomnosť erytroblastov s inklúziami (zloženými z prebytočných α reťazcov a β-abnormálnych reťazcov).
Je opísaných viac ako 30 alel, ktoré indukujú dominantný fenotyp β-talasémie, vrátane mutácií v 3 'oblasti exónov 2 alebo 3, ktoré spôsobujú významné množstvo mutantnej mRNA. V dôsledku toho sa syntetizujú skrátené alebo predĺžené β reťazce, ktoré sú extrémne nestabilné a ktoré sa zrážajú spolu s normálnymi α reťazcami 1. .
Vzťahuje sa na klinický fenotyp spôsobený rôznymi genetickými abnormalitami. Závažnosť medziproduktu β-talasémie sa líši od klinického stavu sprevádzaného spomalením rastu a kostnými deformitami, pri ktorých je prežitie zriedka možné bez krvných transfúzií, až po miernejšie formy podobné β-talasémii, ale spojené s vyšším stupňom. anémie a splenomegálie.
Môžu sa vyskytnúť komplikácie ako: hypersplenizmus, žlčové kamene, preťaženie železom, kompresné javy vyvolané hromadami extramedulárneho hematopoetického tkaniva na životne dôležitých orgánoch.
Hematologický obraz zahŕňa abnormality podobné tým, ktoré sú vyvolané typickou heterozygotnou β-talasémiou, má však vyššiu závažnosť; spolu s mikrocytózou, hypochrómiou, anizocytózou, poikilocytózou, bazofilnými punkciami, polychromatofíliou a cirkulujúcimi erytroblastmi.
Hemoglobínová elektroforéza alebo HPLC naznačuje zvýšené hladiny HbA2 (vyššie ako tie, ktoré sa nachádzajú v krajine β-talasémie) a HbF.
Medzi pacientmi s jedným alebo obidvomi abnormálnymi β-génmi sa môže vyskytnúť stredná beta-talasémia. Tie, ktoré sú homozygotné alebo heterozygotné zlúčeniny pre β-talasemické alely, majú mutácie spojené s miernymi formami β + -talasémie alebo majú zlepšujúce faktory, ako napríklad koexistencia sily a-talasémie alebo mutácia vedúca k zvýšenej syntéze γ reťazca za hematopoetického stresu. Tí, ktorí majú iba jeden abnormálny gén β, majú buď dominantnú formu β-talasémie alebo sú spojené s mutáciami, ktoré zhoršujú nerovnováhu reťazca globínu, ako je napríklad homozygotný alebo heterozygotný stav pre trojitý α alebo štvornásobný α (α gény vynásobené 3 alebo 4 krát).
Genetické testovanie uľahčuje identifikáciu abnormalít, ktoré určujú β-talasémiu medziproduktu fenotyp 1; 5 .
Kombinovaní homozygotní alebo heterozygotní pacienti s mutáciami β-talasémie, ktorí sú závislí od krvných transfúzií, majú klinický stav nazývaný β-talasémia veľká.
Choroba sa často rozpozná v prvom roku života, počnúc vekom 3 mesiace; je charakterizovaná ťažkou anémiou sprevádzanou zrýchlenou erytropoézou, a to v medulárnom aj extramedulárnom sektore. Hematopoetická expanzia vedie k závažným deformitám kostí, najmä kostí lebky a tváre; extramedulárna krvotvorba vedie k masívnej hepatosplenomegálii.
Séria erytrocytov má nasledujúce hodnoty: Hb = 3-7 g/dL, VEM = 50-60 fL, HEM = 12-18 pg. Krvný náter obsahuje výraznú mikrocytózu, hypochrómiu, výraznú anizocytózu a poikilocytózu, bazofilné punkcie, cirkulujúce erytroblasty s hemoglobinizácia a dyserytropoetické znaky.
V prípadoch homozygotnej alebo zloženej heterozygozity pre P0-talasémiu (P0/P0) hemoglobínová elektroforéza alebo HPLC ukazuje na prítomnosť iba HbA2 a HbF; keď majú pacienti homozygotnosť pre β + -talasémiu (β +/β +) alebo zloženú heterozygotnosť pre β 0 a β + -talasémiu (β +/β 0).
Pri hlavnej beta-talasémii môže byť percento HbA2 normálne, vysoké alebo občas nízke 1; 2 .
1. Barbara J. Bain. Diagnóza hemoglobinopatie. Blackwell Science, 2001, 7-9; 73-93.
2. Caterina Borgna Pignatti, Renzo Galanello. Talasémie a súvisiace poruchy syntézy hemoglobínu. In Wintrobe`s Clinical Hematology, 11. vydanie, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1083-1118.
3. Cornel Mironel Niculae. Prepis (prepis). Bioinformatika. fpce9.fizica.unibuc.ro/bioinfo/transcrierea.htm. Typ referencie: Internetová komunikácia.
4. Laboratórium Synevo. Konkrétne odkazy na použitú technológiu spracovania 2010. Typ odkazu: Katalóg.
5. Renzo Galanello, Antonio Cao. Beta-talasémia. Gene Reviews, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov. ReferenceType: internetová komunikácia.
6. Talmaci R, Molekulárna diagnostika -talasémií. Pokroky v biotechnológii, zväzok II. Vyd. Ars Docendi, str. 179-188, 2002.