Biomarkery vo vede o výžive - modelovanie interakcie
Modelovanie interakcie zložiek potravy s bielkovinami
Modelovanie molekulárnych interakcií (Molekulárne modelovanie) sa v posledných desaťročiach etablovalo ako štandardná metóda vo vývoji účinných látok. Na Inštitúte pre výživovú vedu na univerzite v Postupime sa metódy molekulárneho modelovania používajú v interdisciplinárnom výskume zameranom na hodnotenie správania sa nutrične relevantných zlúčenín na molekulárnej úrovni. Charakterizácia takýchto interakcií spolu s funkčnými údajmi zo zavedených biochemických a fyziologických testovacích metód významne prispieva k lepšiemu pochopeniu významu jednotlivých zložiek v potravinách pre prevenciu chorôb závislých od výživy, ako sú kardiovaskulárne choroby, rakovina, diabetes mellitus a neurodegeneratívne choroby.
Pokiaľ ide o bioaktívne zložky potravín, okrem nekovalentných úprav je potrebné očakávať kovalentné modifikácie. Takto upravené molekuly môžu byť tiež potenciálnymi „výživovými cieľmi“, na ktoré sa podobne ako „liečivé ciele“ ako cieľové molekuly v krvi alebo v bunkách tela bioaktívne látky špecificky viažu, a tým vyvolávajú účinky. Okrem toho proteíny často plnia svoju funkciu v spojení s inými biomolekulami ako ligandy. Týmito molekulami môžu byť ďalšie proteíny (interakcie proteín-proteín) alebo metabolity („interakcia proteínov s malou molekulou“), a preto sú zahrnuté v najširšom slova zmysle v smere „interaktomika“. Zásadným rozdielom vo farmaceutickom výskume je to, že zmeny v zložkách potravy (bielkovinách) sa skúmajú mimokorporálne, čo je spôsobené procesmi potravinárskej technológie.
Obr.1 Zastúpenie možných miest pre modifikácie proteínov v skladovacom proteíne kávy upravené z [1]
Cieľ výskumných aktivít molekulárneho modelovania je založený na koncepčnom a analyticko-experimentálnom prístupe k charakterizácii interakcie zložiek potravy a metabolitov s rôznymi proteínmi. Bežné metódy molekulárneho modelovania sú dokovanie (ligand na cieľ; proteín/proteín), štúdie molekulárnej dynamiky a homologické modelovanie proteínov. Tieto metódy budú prezentované na niekoľkých príkladoch z nášho výskumu.
Štúdie dokovacej molekulárnej dynamiky na kávových bielkovinách
Káva je názov pre semená rodu Coffea, ktoré boli zbavené ovocia a kôry semien. Zásobné proteíny v semenách tvoria najväčší podiel z celkového obsahu bielkovín. Hlavnou frakciou je globulárny proteín 11S, čo je hexamér. Šesť podjednotiek s približne 58 kDa sa môže za redukčných podmienok rozdeliť na a a p podjednotku. Kávové zrná patria medzi potraviny najbohatšie na kyselinu chlorogénovú. Jednou vlastnosťou takýchto fenolových zlúčenín je ich náchylnosť k oxidácii. Toto umožňuje pozberové (vo fáze dozrievania a po zbere) reakcie s kávovými proteínmi. V priebehu procesov spracovania a skladovania môžu fenolové zložky rastlinných potravín reagovať s aminokyselinami bielkovín v potravinách.
Obr. 2 Výjazd T3 z TTR. Je zobrazený molekulárny povrch okolo výstupného kanála. Vidíte, že prostredie sa mení z lipofilného (zelené) na hydrofilné (zlaté). Neutrálne alebo menej výrazné vlastnosti sú zobrazené bielou alebo svetlou farbou. Ďalšie informácie nájdete v [4].
Takéto reakcie môžu zmeniť fyzikálno-chemické vlastnosti bielkovín a ich výživovú hodnotu. Proteíny majú rôzne reaktívne vedľajšie skupiny (tiolové, hydroxylové, aminoskupiny), s ktorými môžu vstupovať do kovalentných a nekovalentných interakcií s fenolovými zlúčeninami. Výsledky ukazujú rozsiahlu a veľmi heterogénnu tvorbu aduktu s aminovými postrannými reťazcami lyzínu a cysteínu (Cys). Bol vytvorený katalóg rôznych reakčných produktov a tieto reakčné možnosti boli lokalizované a modelované v zelených kávových zrnách. Za týmto účelom bol najskôr vymodelovaný kávový proteín (homológny model založený na šablónach PDB: 3FZ3-BD, 2D5F-B a 3C3V-A (monomérne) a 3KSC, 2E9Q a 1UD1 (trimér); databáza proteínových vstupov pdb - http: // www .pdb.org/pdb/home/home.do), ktorá definuje „farmakofór“ na reaktívnych amínových bočných reťazcoch ako pomocnú funkciu a simuluje reakciu alebo modifikáciu kávového proteínu pomocou dokovacích štúdií. Podrobnosti prístupov sú opísané v [1] a na obr. 1 sú znázornené možné proteínové modifikácie v kávovom proteíne.
Obr. 3 Východisková štruktúra od Hansona a kol. [6]; Konečná štruktúra novo vypočítaného zlata zafarbeného S1P1; Chyba v počiatočnej štruktúre; nakoniec prepočítané polohy. A) Štartovací model Pdb 3V2Y, B) Finálny model S1P1
„Riadená“ (riadená) molekulárna dynamika na príklade transtyretínu
Transtyretín (TTR) je evolučne vysoko konzervovaný transportný proteín pre hormóny štítnej žľazy (T3, T4) a retinol (v komplexe s RBP4), ktorý sa u ľudí vyskytuje v krvi a mozgovomiechovom moku [2]. Je to homotetramér, ktorého podjednotky pozostávajú zo 127 aminokyselín a ktorý má vysoký podiel β-listových štruktúr [3]. Teraz je pre TTR známe veľké množstvo röntgenových štruktúr. Doteraz sa do veľkej miery využívali štandardné metódy molekulárneho modelovania (dokovanie; homológne modelovanie, proteínový dizajn). Na preskúmanie vplyvu posttranslačnej modifikácie proteínov (PTM) na transport hormónov štítnej žľazy pomocou TTR sa použila metóda „riadenej“ molekulárnej dynamiky (SMD).
Tento prístup ponúka možnosť skúmať dynamiku medzi väzbou a disociáciou biomolekulárneho systému a v našom prípade skúmať rýchlosť výstupu T3/T4 a jeho interakcie s rôzne modifikovaným TTR. Touto metódou sme dokázali, že PTM majú významný vplyv na rýchlosť, ktorou hormón štítnej žľazy vychádza zo svojej väzobnej polohy. To vyplýva na jednej strane z interakcie proteínu s meniacimi sa ligandmi a na druhej strane zo zmien vyskytujúcich sa vo výstupnom kanáli, ktoré môžu ísť až tak ďaleko, že je uzavretý. To možno uviesť do súvislosti s hypo- a hypertyreoidizmom. Obrázok 2 zobrazuje trasu použitú T3 z TTR.
Obr. 4 Kroky procesu vývoja modelu homológu
Homologické modelovanie a dokovacie/väzbové štúdie na receptore sfingozín fosfátu
Sfingosín-1-fosfátové receptory (S1P1 - S1P5) sú membránovo viazané receptory spojené s G-proteínom, ktoré sú zaradené do triedy A (podobné ako rodopsín). Prirodzeným ligandom pre tieto receptory je sfingozín-1-fosfát (S1P). Receptory S1P sú regulované S1P, a preto podliehajú autokrinnej a parakrinnej regulácii s intracelulárnymi a extracelulárnymi účinkami. S1P sprostredkováva rad fyziologických účinkov v organizme a tiež sa podieľa na patofyziologických zmenách. S1P má osobitný význam v imunologických procesoch. Väzbou na receptor S1P1 je zodpovedný za cirkuláciu lymfocytov medzi krvou, lymfami a lymfatickými uzlinami. To viedlo k zavedeniu nového lieku, fingolimodu, na liečbu roztrúsenej sklerózy.
Obr. 5 Viazanie „motýlích spojení“ na S1P1, porovnaj [5].
Michael A. Hanson a kol. v roku 2012 publikoval röntgenovú štruktúru S1P vo vedeckom článku. Rozlíšenie štruktúry bolo okolo 3 Å. Pre naše skúmanie sme použili publikovanú štruktúru 3V2W (obr. 3a, kód Pdb - http://www.pdb.org/pdb/home/home.do) [6]. S1P1 bol fúzovaný s T4 lyzozýmom, aby sa získala stabilná proteínová štruktúra pre kryštalizáciu (obr. 3). Aby sme mali štruktúru vhodnú pre naše vyšetrenia, museli sme odstrániť defekty röntgenovej štruktúry a fúzneho proteínu. Použil sa na to kombinovaný proces homológneho modelovania - MD výpočty „Induced Fit“ dokovania (Induced Fit: proteín je štrukturálne flexibilný ako ligand, ktorý sa má skúmať). Tento postup bol výsledkom relatívne zlého rozlíšenia röntgenovej štruktúry. Model homológu bol potom vytvorený podľa procedurálnych krokov, ktoré sme testovali (obr. 4, vývojový diagram).
Model, ktorý sme vyvinuli, by sa potom mohol použiť na vyšetrenie nových potenciálnych ligandov na S1P1. Pomocou tohto modelu receptora by sa mohlo preukázať, že nové „zlúčeniny motýľov“ (ďalší vývoj imunomodulačného fingolimodu - FTY720) sú schopné pripojiť sa k receptoru S1P1 (obr. 5) [5].
Týchto pár príkladov ukazuje, že nové vzťahy medzi príjmom rôznych zložiek potravy, ich metabolitmi a ich interakciami s bielkovinami sú vynikajúco reprezentované prostredníctvom molekulárneho modelovania, aby bolo možné charakterizovať účinky na určité choroby, a prispieť tak k ich prevencii a identifikácii príčin.
(Prvá publikácia článku: Homann, T., Rawel, H. M., Schweigert, F. J., Kleuser, B. (2015) labor & more 1, 18–22)
Kategória: Veda o výžive Interaktomika