Cesta hradlového náboja draslíkového kanála spojeného s epilepsiou prijíma chemické ligandy

cesta

  • predmetov
  • abstraktné
  • úvod
  • Výsledky
  • Podstatné úlohy konzervovaného fenylalanínu (F137) v aktivite ztz240
  • Identifikácia kritickejších zvyškov v KCNQ2-VSD
  • Štrukturálny model väzby ztz240 na KCNQ2-VSD
  • Objav nových aktivátorov pre vrecko na väzbu ztz240
  • Antiepilepsická aktivita aktivátorov zameraných na dráhu nabíjania brány
  • diskusia
  • Ďalšie informácie
  • Súbory PDF
  • Doplňujúce informácie, obrázok S1
  • Doplňujúce informácie, obrázok S2
  • Doplňujúce informácie, obrázok S3
  • Doplňujúce informácie, obrázok S4
  • Ďalšie informácie, obrázok S5
  • Doplňujúce informácie, obrázok S6
  • Ďalšie informácie, tabuľka S1
  • Ďalšie informácie, tabuľka S2
  • Videá
  • Ďalšie informácie, film S1

Video: Jeep Wrangler Hitch Mounted Cargo Rack XL (1987-2016 YJ, TJ & JK) Recenzia a inštalácia (november 2020).

predmetov

abstraktné

úvod

Výsledky

Podstatné úlohy konzervovaného fenylalanínu (F137) v aktivite ztz240

náboja

Identifikácia kritickejších zvyškov v KCNQ2-VSD

F137 je v strede segmentu S2 KCNQ2 VSD. Navrhli sme viac mutantov pre zvyšky, ktoré lemujú VSD. Z funkčných mutácií E130A, I134A, G138A, R207W a R210A dramaticky znížili potenciačnú aktivitu ztz240 vo všetkých troch hlavných aspektoch. Znížili zvýšenie pomeru prúdovej amplitúdy smerom von (I/I 0) a zabránili alebo tlmili ľavý posun krivky GV (ΔV 1/2) a spomalenie deaktivácie (obrázok 2). Takmer prekrývajúce sa chvostové prúdy týchto mutantov so ztz240 a bez neho jasne ukazujú redukované účinky na deaktiváciu (ďalšie informácie, tabuľka S1). Naproti tomu mutácie S105A a M174A tlmili ľavý posun GV krivky, ale neznížili pomer I/Io ani nezabránili spomaleniu deaktivácie (obrázok 2 a ďalšie informácie, tabuľka S1). Identifikácia niekoľkých podstatných zvyškov ďalej ukazuje dôležitosť VSD pre aktivitu ztz240.

náboja

Identifikácia kritickejších zvyškov v KCNQ2-VSD pre aktivitu ztz240. (A) Reprezentatívne stopy identifikovaných kritických mutantov s alebo bez 10 μM ztz240. (B) Účinky 10 μM ztz240 na amplitúdu externého prúdu mutantov VSD (n> 3). Každé mutačné miesto je indikované na základe predpovedaných transmembránových oblastí. Prerušovaná čiara indikuje úroveň potencionácie 10 μM ztz240 na kanáli KCNQ2 divokého typu. Testovací potenciál je +50 mV. (C) Účinky 10 μM ztz240 na V 1/2 mutantov VSD (n> 3). Δ V 1/2 označuje zmenu V 1/2 po aplikácii ztz240. ΔV1/2 = V1/2 v prítomnosti ztz240 - V1/2 v kontrole.

Štrukturálny model väzby ztz240 na KCNQ2-VSD

Pretože experimentálne štruktúry KCNQ2 a jeho komplexov s inými ligandmi neboli stanovené, je ťažké zostaviť štruktúrny model interakcie ztz240-KCNQ2. V súlade s tým bola použitá hierarchická stratégia na konštrukciu štrukturálneho modelu prostredníctvom rozsiahleho použitia homologického modelovania, molekulárneho dokovania a simulácie MD v spojení s mutagenézou a elektrofyziologickými stanoveniami. Výsledok mutagenézy naznačuje, že potenciálna väzbová kapsa ztz240 sa nachádza skôr vo VSD ako v iných doménach (obrázok 1). Ďalšie elektrofyziologické experimenty ukazujú, že ztz240 sa viaže na VSD v otvorenom stave (ďalšie informácie, obrázok S3). Preto sme najskôr vytvorili trojrozmerný (3D) model pre transmembránovú doménu KCNQ2 na základe štrukturálnych informácií otvoreného kanálu Kv1.2 29, 30, 31 pomocou programu Discovery Studio 2.6 (ďalšie informácie, obrázok S1B).

hradlového

Model väzby ztz240 s VSD. (A., B) Všeobecné (A) a podrobné (B) Pohľady na interakcie medzi ztz240 a VSD. ztz240 a zvyšky sú zobrazené ako guľôčky a tyčinky. Atómy uhlíka, kyslíka, dusíka, chlóru, fluóru a vodíka v jednotke ztz240 sú sfarbené do svetlo modra, červena, tmavo modrej, zelenej, oranžovej a bielej. Pre prehľadnosť je znázornených iba niekoľko kľúčových atómov vodíka. Vodíkové väzby alebo elektrostatické interakcie sú označené červenými čiarami. Interakcia CH-π a halogénová väzba sú označené čiernymi a zelenými čiarami. (C) Štruktúra väzbovej kapsy extrahovaná zo štrukturálnych modelov komplexov ligand-VSD. Ligandy boli kvôli jasnosti odstránené. Povrch tašky je zobrazený žltou farbou. Na pravej strane sú zobrazené tri prierezy vaku z vonkajšej strany. Zvyšky sú zobrazené ako tyčinky. „Von“ a „dovnútra“ označujú vonkajšiu a vnútornú stranu bunkovej membrány.

Väčšina kritických zvyškov lemujúcich väzbovú kapsu je v S2 a S4, ako napríklad E130, I134, F137, G138, R207 a R210, zatiaľ čo veľmi málo zvyškov v S1 a S3 ovplyvňuje spojenie, ako sú S105 a M174 (obrázok) 3)), ktoré nie sú konzervované v izoformách KCNQ. Na ďalšie vyhodnotenie úlohy zvyškov vo vonkajších segmentoch Sl a S3 pri aktivácii ztz240 boli zvyšné zvyšky, s výnimkou zvyškov uvedených v 2B a 2C, vyšetrené alanínovým skenovaním a žiadny z nich významne neovplyvňoval aktivitu ztz240 ( Ďalšie informácie, tabuľka S1)). Tieto ďalšie mutácie a elektrofyziologické stanovenia spätne validujú náš väzbový model ztz240-KCNQ2.

Model interakcie ztz240-KCNQ2 jasne popisuje široké vrecko vo VSD, ktoré sa tiahne od extracelulárneho ústia VSD k R210 (obrázok 3C). Táto možná väzbová kapsa ztz240 v KCNQ2 sa čiastočne prekrýva so zodpovedajúcimi oblasťami hradlových nabíjacích dráh chimérických kanálov Shaker a Kv1.2-2.1, aj keď je rozsiahlejšia a hlbšia (1A a 3C) 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12, 14, 15. Toto zistenie je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami, ktoré naznačujú, že VSD kanálov Kv môžu byť liečiteľnými miestami 19, 20. Naša štúdia tiež zistila, že dráha nabíjania hradla KCNQ2 by mohla mať novú funkcionalitu, ktorá funguje ako vrecko s priamou väzbou pre existujúce a novo vyvinuté aktivátory ako ztz240 a nové zlúčeniny objavené v tejto štúdii (pozri nižšie).

Objav nových aktivátorov pre vrecko na väzbu ztz240

draslíkového

Štruktúrovaný virtuálny skríning identifikuje aktivátory s rôznymi chemotypmi. (A) Zvýšenie amplitúdy externého prúdu v prítomnosti zlúčeniny, ako je uvedené. Testovací potenciál je -10 mV. Prerušovaná čiara označuje úroveň umocňovania 1 (t.j. žiadna umocňovanie). (B) Krivky dávka-odpoveď YG002, YG025 a YG027 (n> 3 pre každý údajový bod). (C) Chemické štruktúry objavených aktivátorov. Fragmenty, ktoré sú orientované smerom k intracelulárnemu koncu VSD, sú zvýraznené oranžovou farbou. (D) Celkový pohľad na superponované väzobné modely deviatich identifikovaných aktivátorov s VSD.

Antiepilepsická aktivita aktivátorov zameraných na dráhu nabíjania brány

Uskutočnil sa primárny antiepileptický skríningový test na hodnotenie aktivity týchto zlúčenín u myší pomocou modelu záchvatov indukovaného maximálnym elektrošokom (MES). Medzi testovanými aktivátormi vykazovali ztz240, YG007 a YG018 mieru ochrany> 50%, a boli preto vybrané na ďalšie skúmanie v modeloch záchvatov indukovaných MES a pentyléntetrazolom (PTZ) (ďalšie informácie, tabuľka S2). Retigabín bol vysadený ako pozitívna kontrola. Všetky tri zlúčeniny vykazovali vynikajúcu antiepilepsickú aktivitu v obidvoch modeloch. V modeli záchvatov indukovaných MES jednorazové podanie troch zlúčenín významne zabránilo predĺženiu tonických zadných končatín. Miera ochrany (100%, 90% a 90%) je porovnateľná s úrovňou retigabínu (tabuľka 1). V modeli záchvatov vyvolaných PTZ vykazovali tieto tri zlúčeniny antiepileptickú aktivitu porovnateľnú s retigabínom. Jedna dávka týchto zlúčenín nielenže významne oddialila latenciu klonov, ale tiež znížila výskyt generalizovaného tonicko-klonického záchvatu (GTCS) a úmrtnosť (tabuľka 2).

diskusia

hradlového

Cesta hradlového náboja kanála KCNQ2 prijíma chemické ligandy. (A) Podrobnosti o tom, ako aktivátory interagujú a ovplyvňujú R207 a R210, keď sú otvorené, na príklade ztz240 a YG002. Aktivátory vyplňujú priestor medzi R207 a R210. Prerušované čiary označujú interakcie medzi aktivátormi a R210. (B) Obrázok ukazuje, ako chemický ligand pôsobí na hradlovú nábojovú cestu tým, že sa nachádza v hradlovej nábojovej ceste, a bráni tak arginínu v pohybe dolu dolu.