Charakterizácia metabolického stavu u nehumánnych primátov s intravenóznou toleranciou glukózy
Zhrnutie
Cieľom tohto protokolu je predstaviť štandardnú metódu intravenóznych testov glukózovej tolerancie (IVGTT) na vykonávanie kontroly glykémie u primátov (okrem človeka) na vyhodnotenie a hodnotenie ich metabolického stavu od zdravého po dysmetabolický.
Abstrakt
Úvod
IVGTT je vhodný funkčný test, ktorý sa bežne používa na stanovenie funkcie β-buniek u ľudí za rôznych metabolických podmienok 5, 7. Na zvieracích modeloch T2D je dobre známy ako nástroj na charakterizáciu zvierat, ktoré vykazujú od progresie metabolického ochorenia zdravé až po dysmetabolický hyperglykemický stav 8, 9. Najbližší zvierací model T2D je uvedený u nehumánnych primátov (NHP), z ktorých jeden je rhesus Makaky Cynomolgus sú pozoruhodnými príkladmi. U týchto zvierat sa prirodzene vytvára T2D s rovnakými rizikovými faktormi veku a obezity, ktoré prispievajú k jeho výskytu ako u ľudí 10. Okrem toho existuje podobná progresia ochorenia a pankreatická patológia, ktorá ukazuje depozity amyloidu ako progresia dysmetabolického ochorenia 11.
Podávame tu správu o našej štandardnej metóde na výrobu IVGTT v NHP ako súčasť našej kolónie charakterizujúcej metabolický stav u týchto zvierat. Táto metóda je ľahká v porovnaní s inými, časovo náročnejšími a nákladnejšími technikami 2. IVGTT je užitočný na rýchlu a častú charakterizáciu veľkej kolónie zvierat. Keď sa vezme do úvahy hladina glykovaného hemoglobínu (HbA1C), história stravovania a príjmu potravy a percento svalovej hmoty a telesného tuku, je IVGTT zvyčajne dostatočný na charakterizáciu 6 metabolického stavu zvieraťa a jeho progresie k zjavnej cukrovke 8.
HbA1C predstavuje priemernú hladinu glykémie počas životnosti červených krviniek a poskytuje spoľahlivú mieru hladín glukózy za posledných šesť týždňov až tri mesiace. Pri meraní zo základnej vzorky krvi nalačno od IVGTT poskytuje táto hodnota okno do kontroly glykémie v mesiacoch medzi zákrokmi. Ak zviera prešlo z dysmetabolizmu od svojej poslednej IVGTT, hodnota HbA1c oveľa vyššia ako jeho predchádzajúca diabetická hodnota by znamenala, že prechod začal krátko po ich poslednom IVGTT, zatiaľ čo hodnota HbA1c bližšia k ich predchádzajúcej hodnote by naznačovala, že nedávno prešli. Hladiny HbA1C vyššie ako 6% sú zvyčajne u makakov rhesus abnormálne a naznačujú zlú kontrolu hladiny cukru v krvi 10, 23.
Glykemické hladiny by sa mali interpretovať z hľadiska správania a celkového zdravia zvieraťa ako celku. Diabetickí makaky - rovnako ako ľudia - vykazujú hyperfágiu, polydipsiu a polyúriu. Skupinové ustajnenie zvierat predstavuje významné problémy pri meraní týchto ukazovateľov a individuálnej starostlivosti potrebnej pre dysmetabolické a diabetické opice. Odporúčame zvieratá chovať jednotlivo, aby bolo možné poskytnúť viac osobnej starostlivosti a ľahšie monitorovať markery správania pre zdravie opice 8. Okrem toho diabetickí makaky budú vykazovať úbytok hmotnosti, zvýšený lipidový profil (zvýšený cholesterol, hypertriglyceridémia) a znížený minerálny metabolizmus v sére. Je dôležité merať markery funkcie pečene a obličiek v chémii séra, pretože poškodenie týchto orgánov často postupuje z dôvodu komplikácií metabolických porúch/cukrovky a môže spolu určovať glykemickú, lipidovú a minerálnu nerovnováhu 9, 11, 18, 24, .
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
Všetky postupy na zvieratách Výskumného ústavu Davida H. Murdocka IACUC, ktorý sa nachádza v areáli výskumného kampusu v Severnej Karolíne (NCRC), boli schválené podľa protokolu 14-017, Charakterizujúci primárny model cukrovky (okrem človeka) a rezistenciu na inzulín/inzulín a účinnosť terapeutík pri zlepšovaní citlivosti na inzulín. a metabolické funkcie.
1. Výber zvierat a príprava na štúdium
2. Sedácia a príprava zvierat
POZNÁMKA: Procedúra IVGTT pozostáva z 8 časových bodov na odber krvi (Stôl 1).
O 100 mg/dl vyššia ako východiskové hladiny glukózy v plazme nalačno.
4. Záchrana zvierat a spracovanie vzoriek
- Odstráňte kanyly a po časovom bode T30 min stlačte katetrizované miesta kvôli hemostáze. Monitorujte zviera, kým nenadobudne vedomie a nesedí. Až sa zviera úplne uzdraví, ponúknite krmivo.
- Ihneď potom je každá vzorka celej krvi v skúmavkách K2 EDTA na ľade. Odstreďujte pri 3000 otáčkach za minútu pri teplote 4 ° C do 10 minút od odobratia. Alikvótne vzorky plazmy do kryových liekoviek, zmrazené a až do analýzy uchovávané pri -80 ° C.
- Pred centrifugáciou pri 3000 otáčkach za minútu pri laboratórnej teplote nechajte krv v sérovej trubici pre štandardnú chemickú analýzu séra stáť pri izbovej teplote najmenej 20 minút a najviac 30 minút. Zmrazte vzorky séra až do vyšetrenia do 48 hodín po odbere.
POZNÁMKA: Chladená celá krv odobratá na CBC analýzu do 24 hodín od odberu Sayed.
- Pred centrifugáciou pri 3000 otáčkach za minútu pri laboratórnej teplote nechajte krv v sérovej trubici pre štandardnú chemickú analýzu séra stáť pri izbovej teplote najmenej 20 minút a najviac 30 minút. Zmrazte vzorky séra až do vyšetrenia do 48 hodín po odbere.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Výsledky sú v ilustrácia 1 Sú zobrazené demonštratívne typické krivky glukózy a inzulínu od dospelých, zdravých a diabetických makakov makakov cynomolgus v priebehu 30 minút IVGTT. Ukázalo sa, že údaje od zdravých a pokročilých diabetických opíc kontrastujú so zjavnými rozdielmi medzi zvieratami z dvoch krajných koncov rozsahu metabolickej charakterizácie. Tento protokol IVGTT autori úspešne použili u makakov rhesus s podobnými výsledkami.
Základné hladiny glukózy nalačno u zdravého makaka (Rhesus a Cynomolgus) môžu byť až 50 až 60 mg/dl 8. Ako je znázornené na obrázku, počiatočná odchýlka glukózy - meraná na T3 - u zdravého NHP nemusí stúpať tak vysoko ako typická východisková hodnota glukózy u diabetického zvieraťa, ktorá často presahuje 200 mg/dl. V priebehu nasledujúcich tridsiatich minút sa hladina glukózy u zdravého zvieraťa často vráti na východiskovú hodnotu, zatiaľ čo dysmetabolické a diabetické zvieratá (Obrázok 1; plné čiary). Sprievodná inzulínová krivka pre zdravé zviera ukazuje dva vrcholy (Ilustrácia 1; modrá prerušovaná čiara), ktoré zodpovedajú počiatočnému, rýchlemu poklesu hladiny cukru v krvi (fáza 1) sprostredkovanému vo väčšej ako normálnej časti periférnymi účinkami inzulínu na transport a príjem glukózy 3, 4. rozsahu týchto periférnych účinkov, dokonca aj počas prvého Fáza inzulínovej odpovede, zníženie sa nerovná príspevku pečene k glukóze, ktorá má počas menšieho, ale pretrvávajúceho druhého vrcholu inzulínu (fáza 2), najväčší vplyv na hladiny glykémie prostredníctvom potlačenia endogénnej produkcie glukózy 1.
Keď zviera postupuje zo zdravého do dysmetabolizmu, v prvej fáze inzulínovej odpovede na bolus dextrózy zvyčajne klesá. vzduch môže sa prejaviť. Avšak AUC zostanú nezmenené, pretože bude dochádzať k častejšiemu celkovému zvyšovaniu produkcie inzulínu, čo bude mať za následok zväčša nezmenené glykemické hladiny v priebehu postupu, pretože zvýšená tvorba inzulínu kompenzuje pokles citlivosti. Akonáhle je zviera zjavne diabetické, produkcia inzulínu dramaticky klesá v reakcii na bolus dextrózy (1; prerušovaná červená čiara). Glykemické hladiny zostanú v priebehu procedúry zvýšené, rovnako ako klírens glukózy teraz nastáva takmer výlučne mechanizmami nezávislými od inzulínu. (1), sa dopravuje.
| Čas | The Časy (min.) | Reálny čas | Množstvo vzorky krvi (ml) | Skúška - príklad | Odčítanie glukometra (mg/dl) | |
| Východisková hodnota | 5 ml | 1,5 ml SST - chémia 0,5 ml K2 EDTA - CBC, HbA1c 3 ml K 2 EDTA + 50 ul Prot -. Glukóza, inzulín, C-Pep | ||||
| 0 | Infúzia dextrózy 250 mg/kg IV podaná počas 30 sekúnd, po ktorej nasleduje 5 ml heparínového soľného roztoku | |||||
| 3 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glukóza, Ins, C-Pep | ||||
| 5 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glukóza, Ins, C-Pep | ||||
| 7. | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glukóza, Ins, C-Pep | ||||
| 10 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glukóza, Ins, C-Pep | ||||
| 15 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glukóza, Ins, C-Pep | ||||
| 20 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glukóza, Ins, C-Pep | ||||
| 30 | 2,0 ml | K 2 EDTA + 30 ul Prot.: Glukóza, Ins, C-Pep | ||||
stôl 1:. Tabuľka postupov IVGTT Zobrazí sa štandardná správa o zákroku pre IVGTT vrátane všetkých dôležitých informácií počas zákroku. Časy aspirácie vzorky po infúzii dextrózy by sa mali počítať od konca infúzie. Skutočné časy by sa mali zaznamenávať pre každé žrebovanie. Kliknutím sem si stiahnete túto tabuľku ako dokument programu Microsoft Word .
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Diskusia
IVGTT hodnotí schopnosť glukózy stimulovaného uvoľňovania inzulínu pomocou jednej infúzie dextrózy na základe telesnej hmotnosti 5, 12, 13. Z testu sa dosiahne hladina cukru v krvi nalačno a hladina inzulínu a umožňuje sa vyhodnotiť schopnosť zvieraťa uvoľňovať inzulín a vráti zvýšenú hladinu glukózy na základnú čiaru. To poskytuje používateľovi informácie na charakterizáciu zvieraťa ako normálnej zdravej kontroly hladiny glukózy a inzulínu, hyperinzulinemického dysmetabolického zvieraťa s normoglykémiou alebo hyperglykemického diabetického zvieraťa rezistentného na inzulín.
IVGTT sú obmedzené ich schopnosťou priamo merať citlivosť na inzulín. Je to predovšetkým užitočné ako metóda na hodnotenie produkcie inzulínu a klírensu glukózy. Avšak hepatálna extrakcia inzulínu z portálneho zásobovania krvou zhoršuje meranie „sekrécie inzulínu“ zo systémového zásobovania krvou. To sa však dá čiastočne prekonať meraním C-peptidu, ktorý sa vylučuje v ekvimolárnych množstvách z pankreasu, ale nie je odstránený pečeňou skôr, ako vstúpi všeobecné zásobovanie krvou. To poskytuje lepší prehľad o produkcii inzulínu na vyhodnotenie lepšej funkcie β-buniek 16. IVGTT tiež nerozlišujú medzi mechanizmami glukózového klírensu závislými od inzulínu a mechanizmami nezávislými od inzulínu 1, 6. Zatiaľ čo citlivosť na inzulín je možné hodnotiť nepriamo minimálnym modelovaním údajov z IVGTT, spoľahlivejšie opatrenia je možné dosiahnuť použitím metód, ako je odstupňovaná infúzia glukózy (GGI), ktorá poskytuje β bunky krivky odpovede na dávku 14, 15.
Citlivosť na inzulín sa však hodnotí iba nepriamo pomocou GGI. Počas IVGTT sa môže zvieraťu podať štandardná dávka inzulínu, aby sa zlepšilo hodnotenie citlivosti na inzulín, čo však bude maskovať endogénnu produkciu inzulínu pred zhoršením hodnotenia funkcie β-buniek. Techniky hyperglykemickej a hyperinzulinemickej svorky priamo merajú reguláciu glukózy prostredníctvom kontrolovanej expozície inzulínu. Nevýhodou metód GGI aj svorkových techník je, že ich vykonávanie je nákladné a ich dokončenie si vyžaduje viac pracovnej sily a času (niekedy až šesť až osem hodín, v závislosti na koncepcii postupu). IVGTT na druhej strane môže do hodiny a s minimom práce.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Zverejnenie
Autori sú aktívne zapojení do zmluvného výskumného ústavu (Crown Bioscience) v oblasti metabolických chorôb.