Charakterizácia molekulárnych mechanizmov protokolu katarakty indukovaného UVR in vivo (preložené do:
Zhrnutie
Katarakta je hlavnou príčinou slepoty na svete. Ultrafialové žiarenie zo slnka (UV) je hlavným rizikovým faktorom pre vznik katarakty. Bol vyvinutý zvierací model široko UVR-B vyvolaného katarakty. V tomto článku popisujeme metódy na štúdium vývoja katarakty: vystavenie UV žiareniu, kvantitatívna RT-PCR a imunohistochémia.
Abstrakt
Katarakta je hlavnou príčinou slepoty na svete. Svetová zdravotnícka organizácia definuje šedý zákal ako zakalenie očnej šošovky, ktoré bráni prenosu svetla. Katarakta je multifaktoriálne ochorenie, ktoré zahŕňa cukrovku, fajčenie, UV žiarenie (UVR), alkohol, ionizujúce žiarenie, steroidy a hypertenziu. Existujú silné experimentálne 2 - 4 a epidemiologické dôkazy 5,6, že UVR spôsobuje šedý zákal. Vyvinuli sme zvierací model pre kataraktu indukovanú UVR B u zvierat v anestézii 7 aj v anestézii zvierat 8.
Jediným liekom na operáciu katarakty je, ale táto liečba nie je dostupná pre všetkých. Odhaduje sa, že oneskorenie nástupu katarakty o 10 rokov by mohlo znížiť potrebu operácie katarakty o 50% 9. Aby sa oddialil nástup katarakty, je potrebné porozumieť mechanizmom tvorby katarakty a používať účinné preventívne stratégie. Medzi metódami vývoja katarakty má apoptóza dôležitú úlohu pri indukcii katarakty u ľudí a zvierat 10. V poslednej dobe sa zameriavame na apoptózu v šošovke ako na mechanizmus vývoja katarakty 8,11,12. Očakáva sa, že lepšie pochopenie účinkov UV žiarenia na apoptotickú cestu poskytne príležitosti na objavenie nových liekov na prevenciu katarakty.
V tomto článku popisujeme, ako je možné kataraktu experimentálne vyvolať vystavením UVR-B in vivo. Viac RT-PCR a imunohistochémie sú prezentované ako nástroje na štúdium molekulárnych mechanizmov katarakty vyvolanej UVR-B.
Protokol
A. Vystavenie ultrafialovému žiareniu
- 15 minút pred expozíciou sa anestetizuje samica potkana Sprague-Dawley zmesou 90 mg/kg ketalaru (ketamín) a 10 mg/kg rompunu (xylazín) intraperitoneálnou injekciou.
- Umiestnite zviera do zadržiavacieho zariadenia pre potkany a ťahajte väzy, kým potkana neimobilizujete bez stlačenia kmeňa 13.
- Na vyvolanie mydriázy nakvapkajte do obidvoch očí potkana mydriacyl (tropikamid), 10 mg/ml.
- Umiestnite zviera tak, aby jedno oko bolo umiestnené proti úzkemu lúču UVR pri 300 nm 10 nm 14 s plnou šírkou v polovici maxima a kontralaterálne oko zakryte čiernou fóliou.
- Jednostranne sa potkan nastaví na podprahovú dávku 1 kJ/m2 UVR-B pri 300 nm na 15 minút 15.
4. Imunohistochemické farbenie
20 min).
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Rôzne zdroje variácií v meraniach boli odhadnuté pomocou analýzy rozptylu a bolo zistené, že pri zohľadnení troch meraní na zviera bolo rozptyl pri meraniach rádovo 15% oproti zvieratám. Vzhľadom na celú analýzu objektívu teda nie je možné zvýšiť presnosť. Ortogonálne testy objasnili štatisticky významný rozdiel pre správu kaspázy-3 medzi 120 hodinovou latenciou oproti kratším intervalom latencie.
Expozícia UVR in vivo indukuje expresiu kaspázy-3.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Diskusia
Tento príspevok popisuje metódy, ktoré umožňujú štúdium molekulárnych dejov, ktoré kataraktu vyvolali počas UVR-B.
Berúc na vedomie, že väčšina informácií o kataraktoch indukovaných UVR in vivo bola odvodená z experimentov na albínskych potkanoch Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, 19, rozhodli sme sa zahrnúť albínsku potkana Sprague-Dawley aktuálna štúdia na použitie. Vek potkanov bol šesť týždňov. Pohlavie bolo vybrané ako ženské, pretože na rozdiel od mužov majú ženy menej alergénny moč. Okrem toho neexistuje žiadny rodový rozdiel v závažnosti katarakty indukovanej UVR 20.
Všetky zvieratá boli držané a liečené podľa ARVO Statement for Animal Use in Ophthalmic and Vision Research. Etický súhlas bol získaný od Etickej komisie pre experimenty so zvieratami v Uppsale, číslo protokolu C 29/10. Potkany sa kupujú od komerčných chovateľov (Taconic, Dánsko).
Stan "> Bol zvolený úzkopásmový zdroj UVR, aby bolo spektrálne dobre definované UVR. Maximálna citlivosť krysej šošovky UVR-B je okolo 300 nm. Dávka 1 kJ/m 2 bola zvolená okolo prahovej dávky 15. Na vyvolanie maximálneho poškodenia šošovky 21 bol zvolený čas pôsobenia 15 minút. Dávka vystavenia UV žiareniu B a po vystavení sa môže líšiť v závislosti od experimentálneho prevedenia.
Spárované oko orgánu má výhodu vo forme štatistík a etiky pri používaní zvierat pri výskume. Jednostranná expozícia oka môže využívať jednu stranu ako exponovanú a druhú stranu ako kontrolu u zvieraťa, takže znižuje počet zvierat na polovicu v porovnaní s nepárovým orgánom.
V tomto protokole sme použili anestéziu ako metódu imobilizácie zvierat. Existuje však aj iná alternatíva, že obmedzovač 13 potkanov, ktorý sme vyvinuli v našom laboratóriu, možno použiť na imobilizáciu neanetizovaných zvierat. Potkany je potrebné pred pôsobením ultrafialového žiarenia kondicionovať na obmedzovači potkanov. Toto zariadenie umožňuje aj kontrolované opakované expozície, keď sa anestézia kvôli jej vedľajším účinkom neodporúča. Tu máme obmedzovač potkanov ako pozicionér a držiak pre zvieratá v anestézii.
Zadržiavač potkanov je vyrobený z dreva a je v našom laboratóriu na rôznych pozíciách. Náš zadržiavací systém čistíme skôr, ako je na ňom umiestnené každé zviera. Drevené bloky, žľaby a drevené prístrešky sa používajú ako obohatenie v klietkach pre potkany. Toto obohatenie je schválené Etickou komisiou pre pokusy na zvieratách v Uppsale a Federáciou európskych asociácií pre laboratórne štúdie zvierat (FELASA).
Objektív musí byť pripravený v BSS za krátky čas (5-10 min). Toto obmedzenie umožňuje, aby šošovka zostala čistá a priehľadná.
Čas 30 minút na vedenie šošovky v lyzačnom pufri RA1 je dostatočný na to, aby sa narušila kapsula a kôra šošovky. Jadro objektívu zostáva tvrdé do 30 minút. Jadro šošovky alebo zóna bez organel sa považuje za neaktívnu súčasť šošovky ako transkripčný faktor. Preto bude jadro zo vzorky odstránené, aby sa zvýšila expresia mRNA v pomere signál/šum.
Primér špecifický pre DNA použitý na kontrolu čistoty RNA (bez DNA) bol vybraný náhodne, aby mal priméry p53. Môže sa zvoliť akákoľvek bežne sa vyskytujúca kódovaná sekvencia DNA, najmä zvierací genóm. Oba ciele boli analyzované pomocou PCR pre 10 zvierat na postexpozičný interval a pre každý objektív bol stanovený obsah RNA kaspázy-3 v troch nezávislých meraniach.
RT-PCR umožňuje merať požadovanú mRNA. Reverzná transkriptáza prevádza mRNA na komplementárnu DNA, ktorá sa potom amplifikuje pomocou PCR. Merania sa kvantifikovali pomocou štandardnej krivky amplifikáciou sériovo zriedených vzoriek získanej cDNA z intERestu. Výhody použitia štandardnej krivky sú v tom, že štandardná krivka poskytuje spoľahlivý spôsob výpočtu neistoty koncentrácie a že štandardná krivka poskytuje kvantitatívne merania sledovanej mRNA. Alternatívne je možné relatívny obsah požadovanej mRNA odhadnúť priamym porovnaním počtu cyklov potrebných na získanie štandardizovaného fluorescenčného signálu pomocou CT postupu. Hlavnou nevýhodou kalibračnej krivky je, že vyžaduje použitie metódy Ct viac ako metódy genomických produktov.
Imunohistochémia sa použila na štúdium priestorovej distribúcie aktívnej kaspázy-3 v epiteliálnych bunkách šošovky.
Oči boli okamžite zmrazené na -70 ° C, aby sa zastavila prebiehajúca biochémia. Oči sa potom konzervovali pri rovnakej teplote.
Imunohistochémia je spojená s dvoma všeobecnými problémami, špecifickosťou primárnej protilátky a nešpecifickou väzbou protilátky. Protilátka by sa mala získavať z dobre kontrolovaného zdroja, čo zaručuje špecifickosť. Pokiaľ je to možné, mal by sa epitop obsahujúci tkanivo zafarbiť ako pozitívna kontrola. Predísť nešpecifickému zafarbeniu Ak je to možné, epitop by mal byť blokovaný pred zafarbením špecifickou protilátkou, negatívnou kontrolou. Ďalej je možné nešpecifické farbenie minimalizovať optimálnou koncentráciou protilátky a reakčným časom. Farbením tak tkaniva vystaveného UVR, ako aj tkaniva nevystaveného UVR je možné produkovať indukovaný UVR epitop, tu kaspáza-3. Na uľahčenie počítania buniek, ktoré produkujú signál kaspapázy-3, sa digitálne zaznamenal obraz fluorescenčného mikroskopu. Aby sme minimalizovali kolísanie šumu v pozadí, máme pevné nastavenie pre všetky mikroskopické obrázky.
Intenzita pozadia fluorescenčného signálu sa mení v kontinuálnej mierke. Preto je potrebné stanoviť prahovú hodnotu pre výrazné zafarbenie. Priemerná fluorescencia sa však môže v pozorovanom úseku priestorovo meniť, čo sťažuje použitie absolútneho prahu pre významnú kontamináciu. Preto je úsudok konkrétneho zafarbenia zvyčajne založený na skúsenom pozorovateľovi a absolútny výsledok špecifického zafarbenia závisí od názoru skúseného pozorovateľa, ale bude pre tohto pozorovateľa konzistentný. Z tohto dôvodu bol použitý iba skúsený pozorovateľ. Na zlepšenie snímania spôsobeného experimentálnou premennou expozíciou UV žiareniu v porovnaní s hlukom sa fotografia každej časti počítala trikrát.
Imunohistochémia by mala byť, kedykoľvek je to možné, potvrdená metódou Western blot na overenie existencie epitopov s očakávanou veľkosťou molekúl.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.