Chemická amputácia a regenerácia hltana v Planarian Schmidtea mediterranea

Zhrnutie

Planarian Schmidtea Mediterranea je vynikajúcim modelom pre štúdium regenerácie kmeňových buniek a tkanív. Táto publikácia popisuje spôsob selektívneho odstránenia orgánu, hrdla, vystavením zvierat chemickému azidu sodnému. Tento protokol popisuje aj metódy monitorovania regenerácie hrdla.

Abstrakt

Planarians sú ploché červy, ktoré sú mimoriadne účinné pri regenerácii. Za túto schopnosť vďačia veľkému počtu kmeňových buniek, ktoré dokážu rýchlo reagovať na akýkoľvek typ poranenia. Bežné modely poranenia u týchto zvierat odstraňujú veľké množstvo tkaniva, ktoré poškodzuje viaceré orgány. Aby sme prekonali toto rozsiahle poškodenie tkanív, popisujeme tu metódu špecifického odstránenia jediného orgánu, hrdla, v Planarian Schmidtea Mediterranea. Dosiahneme to tak, že zvieratá namočíme do roztoku obsahujúceho inhibítor cytochrómoxidázy azid sodný. Krátka expozícia azidu sodnému spôsobí vytlačenie hrdla zvieraťa, čo nazývame „chemická amputácia“. Chemickou amputáciou sa odstráni celý hltan a vytvorí sa malá rana, kde sa hltan nachádza v čreve. Po rozsiahlom opláchnutí si všetky zvieratá po amputácii obnovili plne funkčné hrdlo asi za týždeň. Kmeňové bunky vo zvyšku tela riadia regeneráciu nového hrdla. Tu poskytujeme podrobný protokol popisujúci chemickú amputáciu a histologické a behaviorálne metódy na hodnotenie úspešnej amputácie a regenerácie.

Úvod

Regenerácia je jav, ktorý sa vyskytuje v živočíšnej ríši, s regeneračnými kapacitami od regenerácie celého tela u určitých bezstavovcov po obmedzenejšie schopnosti u stavovcov 1. Nahradenie funkčných tkanív je zložitý proces a často je potrebné súčasné obnovenie viacerých typov buniek. Napríklad salamandrové končatiny, osteoblasty, chondrocyty, nervové bunky, svaly a epiteliálne bunky musia regenerovať 2 vymenené. Okrem toho je potrebné tieto novovytvorené typy buniek správne usporiadať, aby sa uľahčila nová funkcia končatiny. Pochopenie týchto zložitých procesov si vyžaduje techniky zamerané na regeneráciu špecifických typov buniek a ich integráciu do orgánov.

Jednou zo stratégií na zjednodušenie štúdia regeneračných reakcií je cielená ablácia špecifických typov buniek alebo väčšie množstvá tkanív. Napríklad expresia nitroreduktázy v určitých bunkových typoch v zebričke vedie k ich deštrukcii po použití metronidazolu 3, 4. V prípade lariev Drosophila exprimujúcich proapoptotické gény exprimujúce tkanivovo špecifické promótory zamerané na určité oblasti imaginárneho disku 5, 6. Obe tieto stratégie spôsobujú rýchle, ale kontrolované poškodenie a boli použité na disekciu molekulárnych a bunkových mechanizmov zodpovedných za regeneráciu.

V tomto rukopise popisujeme metódu selektívnej ablácie celého orgánu nazývaného hltan v stredomorskom planárnom Schmidtea. Planarians sú klasický model regenerácie, známy pre svoju plodnú regeneračnú kapacitu, kde dokonca aj najmenšie fragmenty celých zvierat 7, 8 dorastajú. Majú veľkú, heterogénnu populáciu kmeňových buniek pozostávajúcu z pluripotentných buniek a pôvodcov s obmedzeným pôvodom 9, 10, 11. Tieto bunky sa množia a diferencujú, aby nahradili všetky chýbajúce tkanivá vrátane hrdla, nervového, tráviaceho a vylučovacieho systému a svalové a epiteliálne bunky 9, 10, 12. Vieme, že tieto kmeňové bunky iniciujú regeneráciu, nerozumieme úplne molekulárnym mechanizmom, ktoré ich poháňajú k nahradeniu týchto rôznych typov buniek. Definované zranené metódy, ktoré môžu vyvolať presné reakcie kmeňových buniek, pomáhajú vymedziť tento zložitý proces.

Hltan je veľká, valcovitá trubica potrebná na kŕmenie, ktorá obsahuje neuróny, svalové, epiteliálne a sekrečné bunky 13, 29. Spravidla sa skrýva vo vrecku na bruchu zvieraťa, rozprestiera sa nad individuálnym telom zvieraťa a otvára sa tak, keď sníma prítomnosť potravy. Aby sme hltan selektívne amputovali, namočíme planárky do chemikálie nazývanej azid sodný, ktorá sa bežne používa v anestézii C. elegans 14, 15, 16. Jeho použitie v planetáriách ako prvé uviedli Adler a kol., 2014-12. Po niekoľkých minútach od vystavenia účinkom azidu sodného planaristi vytlačia hltany a zviera jemným miešaním hltana oddelia. Túto úplnú a selektívnu stratu hrdla nazývame „chemická amputácia“. Týždeň po amputácii je plne funkčné hrdlo obnovené 12. deň Pretože je hltan potrebný na kŕmenie, je možné merať funkčnú regeneráciu monitorovaním správania pri kŕmení. V nasledujúcom texte popisujeme protokol pre chemickú amputáciu a pre hodnotenie regenerácie hrdla a obnovy správania pri kŕmení.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

3. Posúdenie odstránenia hltana po amputácii

Skúmajte zvieratá pod mikroskopom (so zväčšením 10-20x), aby ste zistili, či sa po zrušení výberu hrdla objavila tmavá škvrna, ako je to znázornené na obrázku 2A.zobrazené.
Prípadne zvieratá zafixujte a odfarbte podľa protokolu Pearsona a kol. popísané 20. Namočte zvieratá cez noc do 4 ', 6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) alebo tkanivových kultúr konjugovaných so streptavidínom (1 mg/ml zriedený 1: 500, 1 x fosfátom pufrovaný soľný roztok s 0,3% Triton-X). Zvieratá na podložných sklíčkach v 80% glycerole/20% IX fosfátom pufrovanom soľnom roztoku a obraz pod fluorescenčným stereomikroskopom (obr. 2b)) namontovať.
Poznámka: Všetky obrázky v tomto rukopise boli zachytené na fluorescenčnom stereoskopickom mikroskope s 1,0-násobným cieľom.

4. Vyhodnotenie regenerácie hltana meraním správania pri kŕmení

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Vystavenie pôsobeniu azidu sodného narúša normálnu pohyblivosť plonárskych zvierat a spôsobuje, že zvieratá sa naťahujú a krútia. Tieto pohyby nútia hrdlo vychádzať z brušnej strany zvieraťa a asi po 6 minútach v roztoku azidu sodného je viditeľný biely hrot hrdla. (Obrázok 1 b-vľavo). O niekoľko minút neskôr sa zvieratá aktívne stiahnu a rozšíria hrdlo úplne vytlačením z tela. (Obrázok 1 b-Center). Relaxujte asi 11 minút po vystavení účinkom azidu, zvierat a hrdla. V tejto fáze je jasne viditeľný typický tvar hrdla (Obrázok 1 b-pravá tabla). Pre jednoduchú amputáciu je dôležité počkať, kým sa hltan uvoľní.

Pretože hltan je veľká, nepigmentovaná hmota tkaniva, odstraňuje výskyt tmavej škvrny na chrbtovej strane zvieraťa po amputácii. (Obrázok 2A). Táto tmavá oblasť je vizuálnou indikáciou úspešnej amputácie živými zvieratami. Škvrna je viditeľná ihneď po amputácii a na ďalší deň sa stáva výraznejšou. Keď sa hltan regeneruje, táto oblasť sa zmierňuje. Na dôkladnejšie sledovanie regenerácie hltana je možné zvieratá cez noc zafarbiť aj DAPI alebo tkanivovými kultúrami konjugovanými so streptavidínom. (Obr. 2 b). Aby bolo možné kvantitatívne vyhodnotiť rozsah regenerácie hrdla, možno jeho plochu merať pomocou softvéru ImageJ.

ilustrácia 1 . Vykašliavanie a amputácia hltana. (A) Schematické znázornenie rovinnej anatómie. (B) Živé obrázky zvierat ukazujú hltanové spútum po namočení do 100 mM azidu sodného. Červené šípky označujú hrdlo. Škálovacie pruhy = 750 um. (C) Obrázok živých zvierat (vľavo) a schéma zapojenia (vpravo) amputácie pinzetou. Panely zobrazujú dve rôzne možnosti uchopenia za hrdlo. Bruško zvieraťa smeruje hore. Škálovacie pruhy = 500 um. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 2 . Hodnotenie amputácie a regenerácie hrdla. (A) reprezentatívne obrázky živých zvierat v určitých časoch pred a po amputácii. Stredná oblasť ukazuje po amputácii tmavú škvrnu v oblasti hltanu, ktorá je zvýraznená prerušovaným bielym poľom. Chrbtová strana hore. Škálovacie pruhy = 500 um. (B) reprezentatívne obrázky zvierat zafarbených streptavidínom Alexa488 v určitých časoch pred a po amputácii. Stredný panel zobrazuje absenciu hrdla po amputácii. Oblasť hltanu zvýraznená bielym políčkom. Smerom nahor. Mierka = 500 um. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 3. Vyhodnotenie regenerácie hrdla. (A) Obrázky a schémy testu kŕmenia uskutočneného umiestnením 25 ul pečene do stredu 60 mm Petriho misky. Schéma zapojenia (hore, vľavo) a obrázok (v strede) ukazujú stravovacie správanie zvierat s neporušenými hltanmi. Vpravo hore obrázok zvieraťa, ktoré zjedlo. Schéma zapojenia (vľavo dole) a obrázok (v strede) krmivového správania zvierat 1 deň po amputácii. Vpravo dole zviera, ktoré nejedlo. Stupnica = 750 um. (B) Výsledky testu kŕmenia. Podiel zvierat, ktoré konzumovali jedlo (kvantifikované červeným sfarbením) v určitom čase po amputácii. Pre každý časový okamih n = 10 zvierat, opakovaných v troch opakovaniach. Chybová lišta = SD Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Tento protokol popisuje spôsob selektívnej ablácie hrdla azidom sodným. Ďalšie cielené ablačné štúdie u planariánov použili modifikovanú operáciu na odstránenie fotoreceptorov 21 alebo farmakologickú liečbu na abláciu dopaminergných neurónov 22. Veľkou výhodou chemickej amputácie oproti existujúcim metódam je, že nevyžaduje chirurgický zákrok. Tuhá štruktúra hrdla v porovnaní so zvyškom planárneho tela umožňuje jeho úplné odstránenie zo zvieraťa, ktoré je oveľa mäkším telom. Hltan tiež oddeľuje zviera na malom spoji (pažerák) 30 spájajúcom hltan a črevá, čím sa vytvára viac reprodukovateľná rana, ako je vyvolané väčším chirurgickým nástrojom. Odstránenie hrdla preto kvôli svojim fyzikálnym vlastnostiam a malému anatomickému spojeniu so zvyškom zvieraťa vytvára homogénnejšie rany ako iné chirurgické amputácie.

Pre úspešnosť tejto techniky je rozhodujúce aj trvanie vystavenia účinkom azidu sodného. Aj keď krátke vystavenie účinkom azidu sodného nemá nepriaznivý vplyv na ploštiny, dlhé časové obdobia sú jedovaté a nakoniec usmrtia zvieratá. Je známe, že azid sodný inhibuje energeticky závislé procesy inhibíciou cytochrómoxidázy 23,24. Okrem toho potláča transkripciu a transláciu, pravdepodobne prostredníctvom akumulácie kľúčových zložiek týchto reakcií v stresových granulách 25. U planetárnych jedincov expozícia azidu sodnému potláča mitózu po dobu 24 hodín, po ktorých bunky pokračujú v množení 12. Zmeny ako napr B. Obmedzenie doby vystavenia azidu, vylúčenie azidu sodného dôkladným prepláchnutím a vyváženie mitotickej prepäťovej ochrany v experimentálnom prevedení môže pomôcť tieto limity prekonať.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Zverejnenie

Autori nič neprezradili.

Poďakovanie

Ďakujeme Alejandrovi Sánchezovi Alvaradovi, ktorý sa podieľal na počiatočnej optimalizácii a vývoji tejto techniky. Laboratórium Carolyn Adler je podporované z počiatočných peňazí z Cornellovej univerzity.