Chromatografia

Chromatografia alebo. Chromatografia (Grécky, nemecky Farebné písanie) V chémii sa nazýva proces, ktorý umožňuje oddelenie zmesi látok odlišným rozdelením jej jednotlivých zložiek medzi stacionárnu a mobilnú fázu. Prvýkrát bol tento princíp popísaný v roku 1901 ruským botanikom Michailom S. Tswettom, v roku 1903 bol prvýkrát popísaný na verejnosti a v roku 1906 prvýkrát použil výraz „chromatografia“. Skúmal farebné rastlinné extrakty, napríklad z listového materiálu, a dokázal z nich izolovať rôzne farbivá pomocou chromatografie. Táto metóda sa v praxi používa na jednej strane pri výrobe na izoláciu alebo čistenie látok (= preparatívna chromatografia), na druhej strane pri chemickej analýze sa oddeľujú zmesi látok na čo najjednotnejšie zložky na účely identifikácie alebo kvantitatívneho stanovenia. Chromatografia sa stala neoddeliteľnou súčasťou dnešnej organickej chémie, biochémie, biotechnológie, mikrobiológie, chémie potravín, chémie životného prostredia a tiež anorganickej chémie.

Ďalšie odporúčané odborné znalosti

Vyšší výkon váženia v 6 jednoduchých krokoch

Aký je správny spôsob kontroly opakovateľnosti na váhach?

Ako rýchlo skontrolovať pipety?

Obsah

Opis chromatografického procesu

Najjednoduchší spôsob, ako vysvetliť chromatografiu, je jej porovnanie:

Rozbúrená rieka môže uniesť veľa trosiek. Rýchlosť pohybu plávajúcich trosiek závisí od

druh plávajúcich zvyškov (zrnká piesku sa dopravujú rýchlejšie ako okruhliaky),
charakter koryta rieky (drsné povrchy zvyšujú trenie plávajúcich trosiek a tým znižujú rýchlosť odstraňovania) a
na rýchlosti prúdenia.

Pri chromatografii sa zmesi látok (= plávajúce úlomky) používajú v tzv Mobilná fáza (= Voda) na jednom Stacionárna fáza (= Koryto rieky) prepravované ďalej. Vďaka interakciám (pozri klasifikáciu podľa princípov separácie) medzi vzorkou, stacionárnou fázou a mobilnou fázou, sa jednotlivé zložky prenášajú rôznymi rýchlosťami, a preto je možné ich od seba oddeliť: Na jednom mieste sa vytvorí zmes piesku, veľmi malých a trochu väčších okruhliakov. privezený riekou; napríklad po sto metroch dorazí najskôr všetok piesok (rozprestiera sa na niekoľkých metroch) a po určitej čakacej dobe prídu všetky menšie okruhliaky a oveľa neskôr väčšie, každý sa od seba vzdialí v určitej vzdialenosti.

Ľahšie to pochopíme na príklade: Ak je 45% molekúl A v mobilnej fáze (v priemere), v dôsledku dynamickej rovnováhy sú jednotlivé molekuly A tiež v mobilnej fáze 45% času Fáza výdavkov (v priemere). Preto ich rýchlosť bude v priemere 45% rýchlosti mobilnej fázy. Pre dobré výsledky v chromatografii je rozhodujúce, aby výmena látok medzi dvoma fázami prebehla veľmi rýchlo, to znamená, že jednotlivé molekuly vzorky by mali medzi týmito dvoma fázami (difúzne procesy, pohyb tepla) veľmi často prepínať tam a späť. Predpokladom toho je, aby dráhy, ktoré musia molekuly pokryť zo stacionárnej fázy do mobilnej, boli veľmi krátke. Ak stacionárna fáza obsahuje prášok, veľkosť zrna tohto prášku by mala byť veľmi malá (napríklad len niekoľko mikrometrov). Z určitých dôvodov by mali byť zrná prášku tvarované čo najrovnomernejšie a mali by mať čo najrovnomernejšiu veľkosť (úzke rozdelenie zrna).

procesu

Na chromatografiu je potrebný prietok mobilnej fázy, vstrekovanie vzorky, ktorá sa má separovať, skutočná separácia a detekcia. The Tok mobilnej fázy sa dosahuje buď pomocou tlaku (hydraulické čerpadlo, tlak plynu), kapilárnej sily alebo pomocou elektrického napätia.

The injekcia (= Zavedenie zmesi látok do chromatografického systému) sa uskutoční buď pred vytvorením toku mobilnej fázy (napr. Chromatografia na tenkej vrstve), alebo keď už mobilná fáza prúdi. Pri veľkom počte vzoriek sa na automatizovateľné typy chromatografie (spolu s vlastnými systémami na zber údajov) používajú takzvané autosamplery, ktoré vstrekujú vzorky úplne automaticky.

Potom skutočné Oddelenie zmesi látok na izolačnú vzdialenosť. Bez Detekcia Chromatografia nie je mysliteľná (= objasnenie, keď látka prejde určitou časťou chromatografického systému alebo kde sa látka zastaví po ukončení procesu). Pre každý typ chromatografie sa používajú rôzne detekčné systémy, a to buď použitím fyzikálnych vlastností (absorpcia svetla, fluorescencia, rozptyl svetla, tepelná vodivosť ...) látok, alebo získaním signálu chemickými reakciami. Pomocou chemických reakcií sa napríklad dosahuje zafarbenie v planárnej chromatografii (napr. Aminokyseliny s použitím ninhydrínu) alebo sa reakcie uskutočňujú pred separáciou (predkolónová derivatizácia) alebo po separácii (postkolónová derivatizácia) v kolónovej chromatografii.

V preparatívnej chromatografii a Zberatelia frakcií separovanú látku.

Kvôli konštrukcii sú chromatografické čistiace procesy vždy dávkové. To znamená, že pred pokračovaním v ďalšom množstve je možné naniesť a oddeliť iba určité množstvo látky. Toto je obzvlášť problematické pri spracovaní veľkého množstva, takže boli vyvinuté niektoré procesy, ktoré umožňujú kontinuálnu chromatografiu: prstencová chromatografia, TMB (True Moving Bed) chromatografia a SMB (Simulated Moving Bed) chromatografia.

Definícia niektorých pojmov

Stacionárna fáza

Fáza, ktorá interaguje s jednotlivými látkami zmesi látok a nepohybuje sa. Pobyt analytov počas ich retencie sa strieda medzi mobilnou a stacionárnou fázou (náhodná chôdza) a spôsobuje retenčný čas charakteristický pre látku.

Mobilná fáza

Fáza, v ktorej sa zmes látok zavádza na začiatku separačného systému a ktorá sa pohybuje (fáza na pevnej alebo kvapalnej látke). Mobilné fázy sa líšia svojou elučnou schopnosťou („Sila“, pozri nižšie, „Rozsah Elutrope“), vyžaduje to rôzne retenčné časy a často odlišné selektivity.

Zadržanie

Oneskorenie jednotlivých látok v zmesi látok interakciou so stacionárnou fázou.

Retenčný čas

Čas, ktorý potrebujú molekuly čistej látky na migráciu cez kolónu (od injekcie po detekciu).

Čas prietoku (mŕtvy čas)

Čas toku (predtým tiež „mŕtvy čas“) označuje čas, ktorý musí mobilná fáza alebo látka, ktorá sa nezachytáva, migrovať cez kolónu. Látka nezadržaná (Inertná látka) je v stacionárnej fáze iba v zanedbateľne nízkej koncentrácii, a preto prechádza kolónou súčasne s mobilnou fázou.

Elúcia

Vymývanie (z lat. eluát „Vymytie“) je odstránenie alebo vytesnenie adsorbovaných látok z pevných alebo kvapalinou nasiaknutých adsorbentov a iónomeničov kontinuálnym pridávaním rozpúšťadla (Eluent = mobilná fáza). Vznikne roztok vytekajúci zo separačnej kolóny Eluát zavolal.

Tento proces má osobitný význam pri extrakcii na pevnej fáze.

Eluent

Mobilná fáza, ktorá prekonala izolačnú vzdialenosť.

Eluotropická séria

Usporiadanie rozpúšťadiel bežne používaných ako mobilné fázy podľa ich elučnej sily s referenčnou látkou (zvyčajne silikagél alebo oxid hlinitý). Usporiadanie je možné zvoliť vzostupne alebo zostupne.

Chromatografia

Kolóna: Pri chromatografii je kolónou dutá trubica s priemerom niekoľkých mikrometrov až niekoľkých metrov. Táto skúmavka je buď úplne naplnená stacionárnou fázou (naplnená kolóna), alebo je vnútorne slabo pokrytá (kapilárna kolóna).

Mechanizmus obrátenej fázy

Existujú dva spôsoby oddelenia zmesi látok adsorpčnou chromatografiou:

Normálna fáza: polárna stacionárna fáza (napríklad silikagél, oxid hlinitý), nepolárna až stredne polárna mobilná fáza (ako sú látky HC, dioxán, etylacetát) alebo
Obrátená fáza (Obrátená fáza): nepolárna stacionárna fáza (ako modifikovaný silikagél) a polárna mobilná fáza (ako pufrovaná voda).

V prvom prípade sú lipofilné látky ľahko eluované, polárne látky sú náročné, v opačnom prípade sú polárne látky ľahko eluované („similia similibus solvuntur“).

Pri HPLC sa často používa gradientová elúcia (reverzná fáza), pri ktorej sa zloženie rozpúšťadla pomaly mení (napríklad z 80% na 20% obsahu vody). Alkány vystupujú z kolóny veľmi neskoro a aminokyseliny veľmi skoro a tieto frakcie je možné vylúčiť.

Metódy chromatografickej separácie je možné klasifikovať podľa rôznych aspektov:

Klasifikácia podľa princípu separácie

Základným princípom všetkých chromatografických procesov je často opakované nastolenie rovnováhy medzi stacionárnou fázou a pohyblivou fázou. Rovnováha sa môže vyvinúť v dôsledku rôznych fyzikálno-chemických účinkov.

Klasifikácia podľa použitých fáz

Vďaka mobilným fázam možno chromatografiu rozdeliť do troch oblastí, ktoré je možné rozdeliť do rôznych skupín podľa nosičov stacionárnych fáz alebo fyzikálneho stavu stacionárnych fáz.

Chromatografické parametre

Dĺžka stĺpca Ľ

Čas tokut0

Retenčný častR.

u sa nazýva lineárny Prietok mobilná fáza cez stĺpec, je definovaná ako:

the Retenčný faktork je definované

The Separačný faktor α označuje kvalitu oddelenia dvoch látok. Je to založené na retenčných časoch tR. komponentov v stĺpci. Retenčný čas je čas, ktorý uvažovaný komponent potrebuje na prekonanie kolóny, a zobrazuje sa na maximálnej špičke:

R., the chromatografické rozlíšenie (rozhodnutie) dvoch vrcholov sa počíta z:

alebo

, the Počet stupňov separácie alebo Počet zásobníkov popisuje počet rovnovážnych nastavení látky, ktorá sa má separovať medzi stacionárnou a mobilnou fázou v stĺpci. Čím väčšie N, tým viac rovnovážnych úprav je možné vykonať v určitej dĺžke, čo vedie k lepšej separačnej schopnosti kolóny. N sa vypočíta podľa vzorca:

alebo

B.: Šírka základnej čiary

F.W.HM.: „Plná šírka pri polovičnom maxime“ Fwhm

: Maximálna kapacita; Označuje počet vrcholov v intervale medzi t0 a hodnotu k určitého vrcholu je možné teoreticky od seba oddeliť s rozlíšením R = 1.

H označuje Výška oddeľovacieho stupňa (alebo teoretická výška podlahy) teoretického podnosu (HETP) a predstavuje vzťah medzi dĺžkou stĺpcov a počtom podnosov:

Praktické hodnoty sú v rozmedzí od 0,1 do 0,5 mm.

Výška priečky H

Výška stupňa separácie chromatografickej kolóny je mierou účinnosti separácie kolóny. Pomyselnú časť separačnej kolóny, na ktorej sa raz stanoví chromatografická rovnováha, je možné predstaviť ako separačný stupeň. Čím viac takýchto rovnovážnych nastavení „má na kolóne priestor“, tým nižšia je výška separačného stupňa a tým vyššia je separačná účinnosť kolóny. Na dosiahnutie nízkej výšky separačného stupňa sú pod analytickým podmienky sú potrebné tieto požiadavky:

Očakáva sa rýchla rovnováha adsorpcie alebo distribúcie. Preto by priemer častíc mal byť čo najmenší.
Konštantná teplota v celej kolóne. Môže sa na to použiť stĺpový termostat.
Konštantný prietok: Na to sa používa piestové čerpadlo do 400 bar.
Rozsah lineárnej adsorpcie: Stacionárna fáza by sa nemala v priebehu chromatografie preťažovať.
Bola by žiaduca zanedbateľná difúzia, ale bohužiaľ sa nedá dosiahnuť experimentálne. Preto sa používajú čo najpravidelnejšie obaly s časticami obzvlášť malého priemeru.

Na stanovenie výšky stupňa separácie ako funkcie prietoku eluenta sa môže použiť takzvaná Van Deemterova rovnica pre HPLC:

H výška separačného stupňa,
uX je lineárny prietok.
A. -termín berie do úvahy vírivú difúziu spôsobenú rôznymi cestami toku cez náplň. Platí toto: kde
- faktor balenia,
- d označuje priemer častíc.
The B. -termín zohľadňuje pozdĺžnu difúziu. Pozdĺžna difúzia je difúzia molekúl analytu v oboch smeroch separačného stupňa. Platí toto: kde:
- D. difúzna konštanta v mobilnej fáze a
- Ľ je faktorom bludiska. Labyrintový faktor zohľadňuje pórovú štruktúru stacionárnej fázy.
the C. -termín zohľadňuje rozšírenie píku v dôsledku pomalého nastolenia rovnováhy medzi mobilnou a stacionárnou fázou. Tu je tiež difúzna konštanta D. pozorovať pozdĺž pórov stacionárnej fázy. Platí to

Vrcholová symetria

Teoreticky by každá látka mala opustiť chromatografickú kolónu ako ostrá elučná čiara. Z rôznych dôvodov však majú chromatografické píky vždy určitú šírku. V ideálnom prípade majú tvar gaussovskej zvonovej krivky. V praxi sa však často stáva, že vrcholy sa odchyľujú od tohto ideálneho tvaru a javia sa viac-menej asymetricky. Asymetria, pri ktorej je predné stúpanie vrcholu strmšie ako pokles vrcholu, je známe ako „chvost“, zatiaľ čo efekt, že stúpanie je menej strmé ako pokles, je známe ako „fronting“. Faktor chvosta, ktorý je mierou symetrie vrcholov, sa určuje poklesom kolmice z maxima vrcholu na základnú čiaru a v určitej výške, zvyčajne 10% výšky vrcholu, sú vzdialenosti k prednej časti vrcholu (a) a ku koncu vrcholu (b) ) stanovené. Potom sa vytvorí kvocient týchto dvoch hodnôt, pričom sa používajú rôzne výpočtové vzorce (napr. Podľa IUPAC alebo USP):

Ideálny „Gaussovský vrchol“ dosahuje hodnotu 1, hodnoty nad 1 znamenajú „chvost“, hodnoty pod 1 znamenajú „fronting“.

Praktický experiment

Chromatografiu je možné vykonať doma pomocou komerčne dostupných prostriedkov. Potrebuješ:

filtračné vrecko, pokiaľ je to možné, biele alebo čierne
niektoré farebné ceruzky vo vode rozpustného druhu a určite fixky, ktoré nie sú rozpustné vo vode.

Na spodný okraj filtra na kávu sa nanesie farba a papier sa vloží do misky s vodou tak, aby papier nasiakol vodou.

Pretože je farba pasteliek rozpustná vo vode, voda ju teraz prenáša smerom nahor.

Napríklad červená ceruzka v zásade nie je červená, ale pozostáva zo zmesi rôznych farieb, ktoré sa spolu javia ako červené. V experimente rôzne farebné pigmenty interagujú s papierom v rôznej miere a sú tak vodou transportované viac-menej rýchlo.

Vďaka tomu čoskoro uvidíte niekoľko rôzne zafarbených škvŕn, farby pasteliek sú oddelené chromatografiou.

Aby sa mohla otestovať závislosť separácie na rozpúšťadle, je možné tento experiment uskutočniť znova s rovnakým perom s vodkou, čistením benzínu alebo denaturovaným alkoholom a pozorovať rôzne výsledky. (Toto by sa však malo robiť iba v dobre vetraných miestnostiach, pretože výpary z čistenia benzínu sú toxické.)