Detská laboratórna diagnostika
1 Detská laboratórna diagnostika T. Tulassay
2 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
3 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
4 krvné sérum, plazmatické krvinky látky na laboratórnu diagnostiku erytrocyty, (Hb) leukocyty a iné jadrové bunky (membránové markery, DNA) retikulocyty kostná dreň moč stolica CSF tkanivo plodovej vody (biopsiou atď. (Odber choriových klkov)
5 Klinicko-chemická analýza rôznymi metódami (fotometria, enzymatické stanovenie, chromatografia, hmotnostná spektrometria atď.) Mikrobiologické vyšetrenia, klasická metóda, hmotnostná spektrometria, molekulárno-biologické metódy
6 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
7 Prenatálna diagnostika a prevencia Všeobecné stavy, pri ktorých je nevyhnutný skríning. Genetické choroby, získané enzymopatie Metabolické choroby Chromozomálne abnormality Choroby matky ovplyvňujúce plod (cukrovka, hypertenzia atď.)
8 Prenatálna diagnostika a prevencia Lekárske prostriedky Ultrasonografia (anatomické anomálie). Invazívne vyšetrenia prenatálnej diagnostiky zahŕňajú: amniocentézu, odber choriových klkov a chordocentézu (punkciu pupočníka), abnormality chromozómov, biochemické choroby, DNA, materskú krv alfa z buniek pupočníka izolovať z pupočníkového proteínu materská krv (voľná fetálna DNA). Matky môžu mať cudzie bunky z predchádzajúceho tehotenstva)
10 Normálny chromozómový obraz
13 α-fetoproteín, nekonjugovaný estriol, celkový ľudský choriový gonadotropín (HCG), voľná p podjednotka HCG, inhibín A a plazmatický proteín súvisiaci s tehotenstvom A. AFP, nekonjugovaný Estriol, HCG, bez podjednotky β HCG, PAPP-A, HCG, meranie hustoty krku Tr. + Inhibín A AFP, nekonjugovaný estriol, HCG
14 Praktické informácie Skríning v prvom trimestri sa vykonáva na konci prvej tretiny (prvého trimestra) tehotenstva, v období medzi 11 týždňami +0 dní až do 13 týždňov +6 dní vrátane. PAPP-A je oveľa informatívnejší, najmä v 10. týždni a skôr (8-9 týždňov) ako v 13. týždni. Naopak, voľný β-hcg v 11. týždni má nižšiu výpovednú hodnotu, ktorá sa zvyšuje iba v nasledujúcich týždňoch tehotenstva, s optimom v 2. trimestri (od 14 týždňov).
15 dôvodov pre použitie invazívnych metód prenatálnej diagnostiky: abnormálne nálezy z merania hustoty krku a/alebo kombinované testy abnormálne nálezy pri poruchách rastu ultrazvukom (najmä v druhom trimestri tehotenstva) chromozomálne zmeny v rodine alebo v predchádzajúcom tehotenstve genetické choroby alebo predispozície u pokrvných príbuzných V rodine vysoké hladiny protilátok v krvi u tehotnej ženy negatívnej na rhesus
16 Dôležitým proteínom - AFP alfa-1-fetoproteín (AFP), tiež alfafaetoetoproteín alebo α 1 -etoetoproteín, je glykoproteín u cicavcov, ktorý sa v priebehu embryonálneho vývoja človeka počas tehotenstva z endodermálneho tkaniva a z plodovej pečene alebo najmä u dospelých zvlášť sa tvorí v nádorových bunkách pečene. Fyziologicky má alfa-1 fetoproteín funkciu fetálneho transportného proteínu, ktorý transportuje najmä meď, nikel, mastné kyseliny a bilirubín v krvnej plazme plodu.
17 Veľmi vysoké koncentrácie AFP v krvi matky alebo v plodovej vode naznačujú okluzívne poruchy nenarodeného dieťaťa. Patria sem defekty brušnej steny, ako sú omfalokéla a gastroschíza, a defekty neurálnej trubice, ako je rázštep chrbtice a anencefália. U mužov a netehotných žien môžu vysoké koncentrácie AFP naznačovať aktívnu hepatitídu, cirhózu pečene a karcinóm pečeňových buniek. Nízke hodnoty AFP medzi 14. a 20. týždňom tehotenstva sú známkou Downovho syndrómu (trizómia-21) u nenarodeného dieťaťa.
18 Trisomia 18, Edwardsov syndróm Prevalenze: 1/6 000 Nízka pôrodná váha Zatvorená päsť Malý bedrový kĺb, s obmedzeným bruchom Krátka hrudná kosť Mikrocefália Vynikajúci Occiput Micrognatia Srdce, malformácia obličiek Mentálna retardácia Podrážka v dolnej časti chodidla 95% zomiera 19
20 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
21 Posúdenie kardio-pľúcneho prispôsobenia tlaku kyslíka (po 2) vs. saturácia kyslíkom acidobázická rovnováha Ht
22 Fetálny a neonatálny obeh
23 Fyziologická regulácia na zapamätanie Hypoxia, ET, LT, NO, PGI 2, Pľúcna cirkulácia u plodu je nízka, okolo 40. týždňa tehotenstva dochádza k postupnému zvyšovaniu až 25% srdcového výdaja (CO). Pľúcna rezistencia je ovplyvnená spoluprácou hladkých svalov endotelu (autokrinno-parakrinná regulácia).
25 Alveolárna hypoxia a pľúcna cirkulácia: alveolárna po 2 kontrakcia malých arteriol. Prekážka dýchacích ciest. Posun. Ak> 20%, pľúcna hypertenzia. Circulus vitiosus. Paulev-Zubieta: Nová ľudská fyziológia
26 Pomer alveolárnej ventilácie (V A) a perfúzie (Q) Fyziologický = 1,0 Paulev-Zubieta: Nová ľudská fyziológia
27 Acidobázická rovnováha (SBH) ph: 7,35 - 7,40 Pri pH = 7,40 H + koncentrácia, 40 nmol/l Na + = 140 mmol/l (1,0 milión x vyššia koncentrácia) ph = 6, 1 + log HCO 3/CO 2 Henderson-Hasselbalch
30 Rovnováha prostredníctvom troch obranných mechanizmov Prvá línia: Chemické tlmivé systémy Druhá línia: Dýchací mechanizmus (zmeny v odbore CO 2) Tretí riadok: Renálna kompenzácia (zmeny HCO 3 - vylučovanie)
31 Distribúcia celého tlmivého systému Non-bikarbonátový tlmivý systém 47% Bikarbonátový pufer 53% Hb a OxyHb 35% plazmový bikarbonát 35% Organické fosfáty 3% Erytrocytový bikarbonát 18% Anorganické fosfáty 2% Plazmatické bielkoviny 7%
33 katiónov Anióny Sodík Draslík Vápnik Chlorid horečnatý Bikarbonát Fosfát Sulfát Plazma Intersticiálna tekutina Intracelulárna tekutina Plazmová intersticiálna tekutina Intracelulárna tekutina Organické kyseliny Proteín 100% 80% 60% 40% 20% 0% Katiónové anióny
34 Regulácia objemu kvapalného priestoru ICV ECV PV ISV
35 Regulácia objemu buniek iónovým transportom ECF osm H 2 O Na K H 2 O ECF osm NaCl H 2 O KCl H 2 O
36 Zaobchádzanie s hydrogenuhličitanom obličiek
38 Možnosti kompenzácie pri rôznych acidobázických zmenách Zmena Očakávaná kompenzácia Metabolická acidóza Pco 2 = 1,5 [HCO 3] + 8 ± 2 Metabolická alkalóza Respiračná acidóza Akútna chronická respiračná alkalóza Akútna chronická Pco 2 sa zvyšuje o 7 mm Hg na každých 10 meq/l zvýšenie séra [HCO 3] [HCO 3] sa zvyšuje o 1 na každých 10 mmhg zvýšenie Pco 2 [HCO 3] sa zvyšuje o 3,5 na každých 10 mmhg zvýšenie Pco 2 [HCO 3] klesá o 2 me/l pri každom poklese Pco 2 o 10 mmHg [HCO 3] klesá o 4 pri každom poklese Pco 2 o 10 mmHg
39 Ďalšie laboratórne parametre v postnatálnom adaptačnom období Ht: 0,60-0,65 polyglobulia (syndrómy hyperviskozity) HbF vs HbA hyperbilirubinémia glukóza - hypoglykémia
41 Intenzitná hmotnostná spektrometria Čo je to? Ionizačné molekuly v kondenzovanej fáze + + hmotnostná analýza náboja Ióny v plynnej fáze Ióny v plynnej fáze hmotnosť/náboj
42 Intenzita Hmotnostné spektrum Molekulárny ión s jedným nábojom + Molekulárny ión s dvoma nábojmi Addukcia s jedným nábojom Koncentrácia! Molekulová hmotnosť! Omša/náboj
43 43 Tandemové hmotnostné spektrometrické skríningové testovanie, profil aminokyselín cps + NL (102,00): exp. 2, min. Od vzorky 90 (vzorka 279) DataSET4.wiff (Turbo Spray) e4 8,0e4 7,5e4 7,0e4 6,5e4 6,0 e4 5,5e4 5,0e4 4,5e4 4,0e4 3,5e4 3,0e4 2,5e Max. 8,4e4 cps. Porucha metabolizmu aminokyselín fenylketonúria jávorfaszgenöss betegség (MSUD) tirozinaemie I a II argininosukcinát syntáza a nedostatok liasy homocystinúria neketotická hiperglicinémia defekt cyklu močoviny defekt mitocondria In te ns ity, cps 2.0eeem/z. Am min zo vzorky 90 (vzorka 279) DataSET4.wiff (Turbo Spray) Max. 2,1e4 cps e4 2,0e4 1,9e4 1,8e4 1,7e4 1,6e4 1,5e4 1,4e e4 1,2e4 1,1e4 1,0em/z, porucha oxidácie mastných kyselín amu szénláncú (SCAD) közép szénláncú (mcad) hosszú szénláncú hidroxi-acil (lchad) nagyon hosszú szénláncú (VLCAD) többszörös (MADD vagy GAII) karnitin palmitoil CPT-I Izés II ) Organická acidúria b-ketotioláz hiány glutársav acidémia (GA-I) izovaleriánsav acidémia (IVA) metilmalonsav acidémia (MMA) propionsav acidémia (PA) 3-hidroxi-3-metil-glutaril- CoA -CoA karboxiláz hiány (MCC)
44 galaktozémia, hypotyreóza, nedostatok biotinidázy, fenylketonúria, + 22 zriedkavých chorôb z metabolizmu aminokyselín, oxidácia mastných kyselín a organická acidúria (MS-MS)
45 PKU. Vrodené chyby enzýmov
46 Základné vyšetrenia v prípade podozrenia na neurometabolické ochorenie 1. Materiál Vyšetrenie/parametre Zistená porucha v prípade abnormálneho nálezu Krvná glukóza, elektrolyty Hypoglykémia, poruchy elektrolytov Laktát, BGA AST, ALT, gamagáza, amoniak kreatinín, močovina, aminokyseliny kyseliny močovej, prenos homocysteínu acylkarnitínu kreatínkinázy Krvný náter (vákuované lymfocyty, akantocyty) porucha energie, acidóza, alkalóza hepatopatia, porucha močovinového cyklu nefropatia, porucha metabolizmu purínov poruchy metabolizmu bielkovín, napr. Organoacidopatie Poruchy oxidácie mastných kyselín Poruchy svalov po záchvate Poruchy glykozylácie Skladovacia erózia,
47 Základné vyšetrenia pri podozrení na neurometabolické ochorenie 2. Materiál Vyšetrenie/parametre Osvedčená porucha v prípade abnormálnych nálezov Moč Ketónové telieska Zvýšená oxidácia mastných kyselín (napr. Nalačno), narušenie odbúravania ketónových teliesok Organické kyseliny Mukopolysacharidy, oligosacharidy, kyselina sialová, sulfatidy, organoacidopatie, lochinopatie, lochinopatie, lochinopatie, lochinopatie, Alkohol/plazmatický kvocient) Aminokyseliny (Kvapalina/plazmatický kvocient) Neurotransmiter Metytetrahydrofolát Porucha transportu glukózy (GLUT1) Špecifikácia Aminoacidopatie Poruchy neurotransmisie Nedostatok cerebrálnych folátov
48 Hemoxigenáza 1. Zvýšená tvorba Hb Hem Biliverdin bilirubín-albumín Voľný bilirubín Glukuronyl transferáz Biliverdin reduktáza Nekonjugovaný bilirubín + ligandín BDG Novorodenci: umol/kg/24 h Dospelí umol/kg/24 h 2. Nedostatočná absorpcia BMG 3. Znížená exkrécia BMG BDG Nekonjugovaný bilirubín 4. Zvýšená entero-hepatálna cirkulácia
49 Cholestáza u novorodencov Intrahepatálne ochorenie Poškodenie hepatocytov Poškodenie žlčových ciest Extrahepatálne ochorenie: poškodenie alebo obštrukcia žlčových ciest Biliárna atrézia Metabolické ochorenie Vírusová infekcia Intrahepatálne poškodenie žlčových ciest. Prekážka.
50 Mekónium Dočasné pohyby čriev
51 Defekácia v materskom mlieku Acholová stolica
53 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií (je nutný klinický obraz + diagnostické vybavenie) 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
54 Podozrenie na infekciu. Klinické príznaky Horúčka Zmeny krvného obehu Tachypnoe, apnoe Cyanóza CNS Príznaky Letargia Apatia Bezvedomie Kóma Záchvat Žltačka anémia Krvácanie Trombocytopénia Oligúria, anúria
55 Diagnostika infekcie Stav moču Krvný obraz s diferenciálnym krvným obrazom CRP, prokalcitonín Krk z krvi Krvné kultúry Lumbálna punkcia Vzorka acetónu v moči UTI, leukocytóza nefritídy, leukopénia, posun vľavo,> 15 000/ul, 56 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
57 CHOROBY ENZYMOVÝCH ORGÁNOV Polčas Alfa-amyláza Pankreas, sliny Akútna pankreatitída 9-18 h Alanínaminotransferáza (ALT alebo GPT) Pečeň Zničený pečeňový parenchým 50 h Aspartátaminotransferáza (AST alebo GOT) Pečeň, sval, srdce Zničený pečeňový parenchým, myokard - Choroby h Alkalická fosfatáza (ALP) v pečeni, kostiach, obličkách, parametroch črevných kostí, cholestáze, obštrukcii žlčových ciest, ochoreniach hepatobilia 3-7 dní Cholinesteráza (CHE) v pečeni Zničený pečeňový parenchým 10 dní Glutamát dehydrogenáza (GLD) v pečeni Závažné ochorenie parenchýmu pečene h Gama glutamyltransferáza (GGT), cholestáza pečene, obštrukcia žlčových ciest, ochorenia pečene a žlčových ciest 3-4 dni. Laktátdehydrogenáza (LDH), pečeň, srdce, svaly, erytrocyty, trombocyty, lymfatické uzliny, ochorenie parenchýmu pečene, infarkt myokardu, hemolýza, neúčinná erytropoéza 4-10 hodín
58 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
59 Krv alebo sérum Moč Kreatinín UN Kreatinín, glukózové elektrolyty, bielkovina bilirubín, UBG, krv Disociácia medzi týmito dvoma parametrami môže znamenať katabolizmus Transportné mechanizmy FE Na = U Na * P Cr P Na * U Cr x100 Mikroskopické vyšetrenie moču
60 erytrocytov zavedených hemoglobínu zavedených leukocytúria, bakteriúria leukocytových infekcií
61 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
62 Počet erytrocytov Hb Ht MCV MCH MCHC Najčastejšie vyšetrenia Retikulocyty Sérum železo, feritín, transferín Počet leukocytov, krvný náter Náter na kostnú dreň Hb elektroforéza
63 Laboratórna diagnostika mikrocytickej anémie Krvný náter (pozor na cieľové bunky, infekčné bunky) Železo v sére; ak nie je diagnóza, potom feritín (transferín); ak nie je diagnóza, potom Hb elektroforéza; ak ziadna diagnoza, tak natierka kostnej drene
64 Diferenciálna diagnostika mikrocytickej anémie Ochorenie/kritérium infekcia s nedostatkom železa/nádor Sideroblastická anémia cieľové bunky nie nie nie áno MCV/RBZ> 13> 13> 13 65 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
66 Existuje len málo laboratórnych markerov pre gastrointestinálne ochorenia špecifických pre dané ochorenie. Pri malabsorpčných syndrómoch vzniká reabsorpčný defekt (napr. Nedostatok železa). Chronické zápalové črevné zvíjanie Hb a Fe sa znížilo, IgG a CRP sa zvýšili, leukocytóza s posunom doľava, trombocytóza v stolici: kalprotektín špecifický, pochádza z leukocytov) Pri imunitných ochoreniach, ako je celiakia, IgA protilátky proti gliadínu IgA protilátky proti transglutamináze
67 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
68 Najčastejšie hematoonkologické ochorenia u detí 0-4 roky 5-9 rokov Leukémia Leukémia Retinoblastóm Retinoblastóm Neuroblastóm Neuroblastóm Wilmov nádor Nádory CNS Hepatoblastóm HCC HCC Teratóm Nádory CNS Osteosarkóm Rabdomyosarkóm Ewingov sarkóm Nádory CNS Lymfóm Hodgkin
69 Najčastejšie hemato-onkologické ochorenia u detí 0-4 roky 5-9 rokov Nádorové markery Leukémia Leukémia Retinoblastóm Retinoblastóm Neuroblastóm Neuroblastóm NSE Wilmov nádor Lymfóm Hodgkin hepatoblastóm HCC HCC AFP Teratóm Rhabdomyosarkóm Ewing sarkóm Nádory CNS Nádory CNS Nádory CNS
70 Obsah 1. Všeobecné poznámky 2. Prenatálna diagnostika 3. Laboratórna diagnostika v postnatálnom adaptačnom období. Novorodenci 4. Diagnostika CNS a infekcií 5. Hepatológia 6. Nefrológia 7. Hematológia 8. Gastrointestinálne ochorenia 9. Nádorové markery 10. Genetické diagnostické možnosti
72 Normálny chromozómový obrázok
75 Rôzna veľkosť (kb) Alela: variácia génu na určitom mieste chromozómu Diploid: gén na homológnom chromozóme má dve kópie v somatických bunkách. Mutácia Enzymdefeková alela spojená s fenotypom môže byť buď dominantná, alebo recesívna. Dominantná alela funguje, keď je tam len jedna alela. Recesívne alely môžu fungovať iba vo dvojiciach.
76 SNP: zmenená sekvencia párov báz. Napríklad: AAGCCTA vs. AAGCTTA Táto variácia môže brať do úvahy SNP, iba ak sa objaví u 1% populácie. SNP sa objaví 1krát v 300 nukleotidoch. Vďaka tomu môže byť v ľudskom genóme prítomných 10 miliónov SNP. Na čo slúžia? 1. Biologické markery (výskum génov). 2. Ak sa SNP objaví v géne alebo v regulačnej oblasti blízko génu, môže meniť génové produkty (proteíny).
78 Bežné genetické mutácie identifikované prostredníctvom GWAS. Zdroj: NHGRI katalóg publikovaných GWAS
79 Exóny sú navzájom spojené nepreloženými oblasťami (UTR). V ľudskom genóme, cc. Nájsť 180 000 exónov. Predstavujú 1% DNA, 30 megabáz.
80 Exome sekvenovanie (Cielené zachytenie exomu, sekvenovanie novej generácie (NGS)). Efektívna stratégia iba na určenie sekvencie kódujúcich génov. Alternatíva k GWAS
81 2 prvky epigenetického kódu DNA metylazion. Metylové skupiny inhibujú aktiváciu génovej modifikácie histónu.