Diplomová práca. Predložené na získanie diplomu z biológie na Biologickej fakulte Ruhr University Bochum

Diplomová práca Predložená na získanie diplomu z biológie na Biologickej fakulte Univerzity Ruhr Bochum Analýza extrahovateľných a neextrahovateľných zvyškov sulfadiazínu a jeho metabolitov tri roky po aplikácii bravčového hnoja na lyzimetre a remobilizáciu neextrahovateľných zvyškov aktivitou rizosféry kukurice Pripravil Wibke Schulte-Hunsbeck v odbore Fyzická geografia/Pôda/Ekológia pôdy na Fakulte geovied Bochum v septembri. Rečník za rok 2009: Prof. Dr. Bernd Marschner Spolurozhodca: Prof. Dr. Dominik Begerow

Táto diplomová práca bola vytvorená v priateľskej spolupráci s firmou Forschungszentrum Jülich GmbH, členom Združenia nemeckých výskumných centier Helmholtz. Inštitút Agrosféra ICG 4 Forschungszentrum Jülich GmbH 52425 Jülich (budova 16.6) Vedúci ústavu: Prof. Dr. Harry Vereecken kontakt na mieste: Dr. Joost Groeneweg

Vyhlásenie Prehlasujem, že som diplomovú prácu, ktorú som dnes predložil, vypracoval samostatne a že som nepoužil iné zdroje a pomôcky, ako sú uvedené, a že som označil citácie. Táto diplomová práca pozostáva zo štyroch kópií, ktoré sú úplne identické slovom aj obrazom. Tiež vyhlasujem, že digitálne obrázky obsahujú iba pôvodné údaje a že na vykonanie zmeny obsahu nebolo vykonané žiadne spracovanie obrazu. Vedúcim práce bol: Prof. Dr. Bernd Marschner Ako spolurozhodcov navrhujem: Prof. Dr. Dominik Begerow Bochum, (titulok)

Obsah Obsah Zoznam čísel Zoznam tabuliek Zoznam skratiek a symbolov 1! Úvod. 13! 1,1! Sulfadiazín. 15! 1,2! Prehľad literatúry. 16! 1.2.1! Preprava látok v zemi. 16! 1.2.2! Sorpcia v pôde. 19! 1.2.3! Neextrahovateľné zvyšky. 24! 1.2.4! Preprava absorpcie SDZ v závode. 25! 1.2.5! Členenie SDZ v pôde. 26! 1.2.6! Degradácia SDZ fotochemicky. 27! 1.2.7! Degradácia SDZ u cicavcov. 28! 1,3! Stanovenie cieľov. 30 2! Materiál a metódy. 31! 2,1! Opis skúšobných podláh. 31! 2.2! Lyzimeter. 33! 2.2.1! Vyskúšajte lyzimeter. 35! 2.2.2! História a počiatočný stav testovaných lyzimetrov. 36! 2,3! Charakterizácia testovanej látky. 37! 2,4! Metódy. 38! 2.4.1! Odber vzoriek pôdy. 38! 2.4.2! Príprava vzoriek pôdy. 39! 2,5! Sprievodné parametre. 40! 2.5.1! stanovenie hodnoty ph. 40! 2.5.2! Stanovenie vlhkosti pôdy. 40! 2,6! Ťažba pôdy. 41 ! 6.!

Obsah 2,7! Extrakcia na pevnej fáze. 43! 2,8! Skúška rastlín. 45! 2.8.1! Experimentálne nastavenie. 45! 2.8.2! Rastliny na odber vzoriek. 47! 2,9! Analytické metódy. 48! 2.9.1! Okysličovadlo. 48! 2.9.2! Meranie LSC. 50! 2.9.3! LC-MS/MS. 51! 2,10! Vyhodnotenie. 54 3! Výsledky. 56! 3,1! Lyzimetrické experimenty. 56! 3.1.1! 0,5 m! -Lyzimetrické testy. 56! 3.1.2! 1 m! -Lyzimeter. 68! 3,2! Skúška rastlín. 74 4! Diskusia. 83! 4,1! Lyzimeter. 83! 4.1.1! Sprievodné parametre. 83! 4.1.2! Vyvažovanie SDZ v lyzimetroch. 85! 4.1.3! Postupná extrakcia a analýza metabolitov. 90! 4.1.4! Sorpcia SDZ. 94! 4,2! Skúška rastlín. 97! 4.2.1! Sprievodné parametre. 97! 4.2.2! Remobilizácia sekvestrovaného SDZ prostredníctvom aktivity rizosféry. 98! 4,3! Zhrnutie. 100 5! Bibliografia. 101! 6! Príloha A. 106 ! 7.!

Obsah Tabuľka 20: Ekvivalentná koncentrácia (ekv.) SDZ [mmol g -1] postupnej extrakcie zo vzoriek pôdy z testu lyzimetra a testu výsadby A2 (Kal) a B2 (Mer). 81! Tabuľka 21: Koncentrácia SDZ a jeho metabolitov [mmol g -1] extrakcie aceto. + H20 vo vzorkách pôdy z experimentu s lyzimetrom a experimentu s výsadbou A2 (Kal) a B2 (Mer). 82! Tabuľka 22: Ekvivalentné množstvo (ekv.) SDZ [mmol] sekvenčnej extrakcie zo vzoriek pôdy lyzimetrom A1 (Kal) do hĺbky 30 cm v deň vzorkovania 29., 120, 218, 1022. 106! Tabuľka 23: Ekvivalentné množstvo (ekv.) SDZ [mmol] postupnej extrakcie zo vzoriek pôdy lyzimetrom B1 (Mer) do hĺbky 30 cm v deň vzorkovania 29., 120, 218, 1022. 107 ! 11!

Obsah Zoznam skratiek a symbolov Skratka 4-OH-SDZ 4-Hydroxysulfadiazín APG aktivita na gram pôdy [Bq g -1] Rovnocenné ekvivalentné množstvo [mmol] Aceto. Acety-SDZ BBA c eq Acetonitril N-acetyl-sulfadiazín Pokyny pre testovanie prípravkov na ochranu rastlín a ekvivalentných koncentrácií zariadení na ochranu rastlín [mmol g-1] DNA deoxyribonukleová kyselina FZJ Forschungszentrum Jülich GLP Dobrá laboratórna prax HPLC Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia ICG-4 inštitút Agrosphere K/B Kick/Brauckmann cievy k OC LC-MS/MS LSC Mer MRSA MS NER PKs Sorpčný koeficient (n = vhodný pre organický uhlík) kvapalinová chromatografia spojená s tandemovou hmotnostnou spektrometriou Kvapalinová scintilácia Počítadlo Merzenhausen multirezistentné kmene Staphylococcus aureus Hmotnostný spektrometer Neextrahovateľné zvyšky negatívny dekadický logaritmus kyslej konštanty K s! Hustota [g cm - "] SDZ Sulfadiazín Štandard SOP Návod na obsluhu SPE Extrakcia na pevnej fáze WHO Svetová zdravotnícka organizácia Wk max Maximálna kapacita zadržiavania vody [%]! 12!

Úvod SDZ Transport v pôde Štúdie transportu s SDZ ukázali, že rôzne výsledky vedú k aplikácii SDZ s vodou alebo s tekutým hnojom. Ak sa SDZ aplikuje spolu s tekutým hnojom, vyšetrovanie Burkhardta a kol. (2005), Kay a kol. (2005) a Blackwell a kol. (2007), ktorá suspenzia uprednostňuje povrchový odtok SDZ. Výskumy preukázali, že tekutý hnoj vďaka svojmu pevnému obsahu uzatvára jemné pôdne póry a SDZ tak odteká rýchlejšie ako iné antibiotiká (Burkhardt et al., 2005). Typ pôdy je tu irelevantný, rýchly povrchový odtok bol pozorovaný ako v hlinitých pôdach (Blackwell et al., 2007), tak aj v piesočnatých pôdach (Kay et al., 2005). Ak sa SDZ aplikuje na hnojovicu, vstupuje SDZ do pôdy preferenčným tokom, okrem iného, ako ukazujú štúdie Burkhardta (2007). 18!

Iniciujte radšej jeho koncentráciu. Čím vyšší je podiel iónu v pôdnom roztoku, tým vyšší je jeho podiel v iónovom povlaku (Schroeder a Blum, 1992). Vnútorno-sférický komplex SDZ je založený na tvorbe komplexných zlúčenín a poskytuje špecifickú sorpciu. Molekula alebo ión pôdneho roztoku pôsobia ako ligand a vytesňujú ligand koordinovaný okolo centrálneho atómu kovového iónu. Vďaka vytvoreniu kovalentných väzieb medzi ligandmi sú tieto vnútorne sférické komplexy veľmi stabilné (Scheffer a Schachtschabel, 2002). Obrázok 3: Sorpcia katiónov na povrchu oxidu alebo ílu s premenlivým nábojom (Sigg & Stumm 1994 Aquati Chemistry, Teubner, Stuttgart).! 21. deň!

Zavádzanie oxidu uhličitého je vylúčené. Iba 14% podielu 2% z celkového množstva sa pridelilo 14 CO 2. To ukazuje, že SDZ sa môže v pôde rozkladať len veľmi pomaly. Pri súčasných výskumoch bolo možné urobiť tvrdenia o degradačných produktoch, pomocou ktorých boli identifikované 4-OH-SDZ, formyl-SDZ a 4- (2-minopyrimidinyl-1 (2H)) anilín (okrem iného: Sukul et al., 2008). 1.2.6 Fotochemická degradácia SDZ Degradácia SDZ slnečným žiarením (UV žiarením) je čisto abiotický degradačný mechanizmus. O fotolytickú degradáciu sa okrem iného zaslúžili Sukul a kol. (2008) a Wollters a Steffens (2005). Ak sa SDZ nanáša v suspenzii, je dlhšie vystavený UV žiareniu. Táto cesta rozkladu pre SDZ je v pôdach možná len obmedzene. Fotochemická degradácia silne závisí od hodnoty ph, a teda od okolitých zložiek. V prípade fotochemickej degradácie dominuje nepriama fotolýza (Wolters a Steffens, 2005). Komponenty excitované svetelnými kvantami môžu preniesť túto stimuláciu na SDZ a stimulovať ju tak k rozkladu. Fotocitlivé látky môžu spôsobiť zvýšenie fotodegradácie, napríklad peroxid vodíka, humínové kyseliny, fulvokyseliny a acetón (Sukul et al. 2008).! 27!

Úvod 1.2.7 Degradácia SDZ u cicavcov Počas biotransformácie SDZ u ošípaných sa vylúči 96% podaného SDZ označeného 14C. To znamená, že zviera prijme iba 4%. Biotransformáciu SDZ u ošípaných opísali Lamshöft et al. (2007) podrobne preskúmané. Rádioaktívne značený SDZ (14C-SDZ) sa prasatám podával štyri dni a ich výlučky (hnoj) sa zhromažďovali každý deň po dobu 10 dní po podaní. Odobraté vzorky suspenzie sa analyzovali na SDZ a jeho metabolity. Spolu s hlavnými metabolitmi sa vylúčilo 44% SDZ. Hlavné nájdené metabolity boli acetyl-SDZ (21%) a 4-OH-SDZ (26%). Ďalšie sekundárne metabolity boli N-formyl-sulfadiazín (0,1%) a N-acetyl-4-sulfadiazín (1,8%). Maximálne vylučovanie sa vyskytlo šiesty deň po podaní. Pri distribúcii aktivity v hnoji sa 80% zistilo v tuhej hmote a 20% v kvapalnej fáze. Obrázok 7 zobrazuje produkty degradácie SDZ u ošípaných. Obrázok 7: Degradácia 14 C-SDZ biotransformáciou (* = umiestnenie značky 14 C) (Lamshöft et al., 2007).! 28!

Úvod K rozkladu obvykle dochádza u cicavcov v dvoch fázach. V prvej fáze pôsobia enzýmy ako napr Monooxygenáza a reduktáza štiepia funkčné skupiny alebo, ako pri hydroláze, sú pripojené funkčné skupiny (-OH). V druhej fáze je výsledný metabolit spojený s endogénnou vo vode rozpustnou látkou. To zvyšuje rozpustnosť látky, ktorá sa má odbúrať, vo vode, a preto sa môže ľahšie vylučovať. SDZ sa vylučuje hlavne obličkami a iba v malej miere pečeňou a črevami (Sukul a Spiteller; 2006). SDZ sa úplne konvertuje späť do formy SDZ v hnoji z metabolitov (Langhammer, 1989). Tabuľka 3: Charakterizácia dvoch hlavných metabolitov 4-OH-SDZ a acetyl-SDZ 4-hydroxysulfadiazín N-acetylsulfadiazín (4-OH-SDZ) (acetyl-SDZ) vo forme súčtu C 10 H 11 N 4 O 3 SC 12 H 14 N 4 O 4 S molárna hmotnosť 267,27 g/mol 310,32 g/mol! 29!

Materiál a metódy Kaldenkirchen (Kal) Braunerde N: 51 18 25 O: 6 12 12 Merzenhausen (Mer) Parabraunerde N: 50 55 50 O: 6 17 47 Obr. 8: Prehľad polných polôh: Merzenhausen (Mer) a Kaldenkirchen (Kal) v NRW.! 32!

Materiál a metódy Obr. 9: Schematický nákres vonkajšieho lyzimetrického systému ICG-4 so zapusteným uhlovým 1 m! Podlahový monolit (Pütz, 1993) 34!

Materiál a metódy 2.3 Charakterizácia testovanej látky Kvapalný hnoj použitý v tomto pokuse z kŕmnych pokusov, ako ich opísali Lamshöft et al. (2007) Oddiel 1.2.7. Použitý 14C-SDZ s 99% čistotou mal špecifickú aktivitu 8,6 MBq mg-1 a bol vyrobený spoločnosťou Bayer AG, Wuppertal. SDZ bol rádioaktívne značený na atóme 2C anilínového kruhu (14C-SDZ), pozri obrázok 11. SDZ značený 14C bol zmiešaný s neznačeným SDZ v pomere 1:20 (hmotn./hmotn.). Neoznačený SDZ dodal Fluka, Seelze. Rádioaktívne značený SDZ (14C-SDZ) sa podával dvom ošípaným. Paralelne sa neoznačený SDZ podával orálne ďalším dvom ošípaným do 4 dní. Zvieratá, ktoré dostali 14 C-SDZ, dostali celkovú dávku 540 mg d-1 (928,8 MBq). To zodpovedá 30 mg kg -1 d -1 telesnej hmotnosti. Zvieratá, ktoré dostávali neoznačený SDZ, dostávali celkovú dávku 570 mg kg -1 d-1 telesnej hmotnosti. Vzorky tekutého hnoja zhromaždené každý deň po dobu 10 dní sa analyzovali pomocou detekcie 14 ° C. Obr. 11: 14 C-značený sulfadiazín (14 C-SDZ) (* = umiestnenie označenia 14 C) (Lamshöft et al. 2007) 37

Materiál a metódy 2.4.2 Príprava vzoriek pôdy Pre nasledujúce analýzy bola pôda preosiata na 2 mm a prenesená do PE vriec. Potom sa v pôde vlhkej na poli stanovila hodnota pH a pôdna vlhkosť. Pre ďalšie analýzy sa pôda sušila pri 105 ° C do konštantnej hmotnosti. Potom sa približne 200 g homogenizovalo v planetárnom mlyne (Retsch PM4) (15 minút pri 250 otáčkach za minútu; Förster a kol., 2009). V prípade planetárneho mlyna odstredivá sila tlačí mletý materiál (vzorka pôdy) s mlecími guľami (päť kusov) na stenu mlecej misky a trením ho drví. Schematické znázornenie pracovných krokov je možné vidieť na obrázku 12. Obr. Polná čerstvá pôda na 2 mm sedem sprievodných parametrov (hodnota ph, pôdna vlhkosť) - sušenie - homogenizácia - extrakcia pôdy - oxidant - analýza LSC -LC-MS/MS Obr. 12: Vývojový diagram pracovných krokov spracovania vzorky pôdy. 39!

Materiál a metódy 2.5 Sprievodné parametre 2.5.1 Stanovenie hodnoty pH Hodnota ph je stanovená na základe normy DIN ISO 10390. Hodnota ph sa stanoví v suspenzii pôdy a roztoku chloridu vápenatého (0,01 M) po jednej hodine expozície za občasného zmiešania s ph metrom. Ph meter je pred použitím kalibrovaný pomocou štandardných tlmivých roztokov ph 4 a ph 7 (Blume et al. 2000). Podmienky analýzy Pre každú vrstvu pôdy sa uskutočnili tri opakovania. ph-meter: Mettler Toledo 1120X Váženie: 10 g pôdy vysušenej na vzduchu Činidlo: 25 ml 0,01 M roztoku chloridu vápenatého 2.5.2 Stanovenie pôdnej vlhkosti Pôdna vlhkosť je jedným z najjednoduchších parametrov na popis vodných pomerov pôdy. Pôdna vlhkosť sa nemeria priamo, ale nepriamo, tj gravimetricky, obchádzkou hmotnosti. Vlhká pôda, čerstvá z poľa, sa naváži a vysuší do konštantnej hmotnosti. Stanovenie pôdnej vlhkosti sa vykonáva na základe DIN ISO 11465 (1996-12). Pôdna vlhkosť sa udáva v pomere k vlhkej hmote pôdy v hmotnostných%. Podmienky analýzy Pre každú vrstvu pôdy sa uskutočnili tri opakovania. Suchá váha: Mettler Toledo HB43-S Halogénová hmotnosť: 0,3 g - 2 g pôdy! 40!

Materiál a metódy Tab. 6: Schematická sekvencia sekvenčnej extrakcie podľa Förster et al. (2009). Naváženie: 10 g pôdy v centrifugačných skúmavkách Extrakcia CaCl2 Me-OH extrakcia Aceto.-H20 extrakcia - Činidlo: 25 ml, 0,01 M roztok CaCl2 - 24 h pretrepávanie nad hlavou - centrifugácia * - dekantácia - váženie Odmerajte supernatant - 1 ml v LSC (scintilátor: 10 ml Ultima Gold) - činidlo: 25 ml, metanol - pretrepte 4 hodiny nad hlavou - centrifugácia * - dekantácia - odvážte supernatant - odmerajte 2 ml v LSC (scintilátor: 10 ml Instagel) - mikrovlnná digescia -Reagent: 50 ml 1: 4 (v: v) acetonitril: voda! Vezmite 20 ml zo suspenzie pôdneho rozpúšťadla. -Centrifugácia ** -dekantovanie - odváženie supernatantu - v LSC odmerajte -1 ml (scintilátor: 10 ml Instagel)! Zvyšný extrakt - odstreďovanie * - dekantácia - váženie supernatantu - vyradenie supernatantu vysušte dno v skúmavkách centrifúgy pre neskoršie spálenie v oxidačnom prostriedku *: Allegra 6KR, 30 min. Pri 900 * g **: J2-21 HS, 30 min. Pri 40 000 * g! 42!

Materiál a metódy Tabuľka 7: Pracovné kroky na čistenie extraktov CaCl2 pomocou SPE. Krok Objem činidla 1 3 ml metanolu 2 3 ml 5:95 metanol: destilovaná voda 3 3 ml destilovanej vody Voda 4 X * CaCl2 extrakt 5 obj. 20 ml. Voda 6 Kazeta sa suší 15 minút 7 3 ml metanolu Okyslené na pH 2 *: Extrakt CaCl2 sa spojí pred nanesením na kolónu, 1 ml sa odstráni a meria sa v LSC. Zvyšok sa odvážil a centrifugoval (30 minút pri 40 000 x g; J2-21HS). Supernatant sa naniesol na kolónu. Podmienky analýzy SPE kolóna: Oasis HLB 6 cc-200 mg (Waters Oasis) Vákuová pumpa: Vacumbrand SPE nástavec: SPE-24G Kyselina na okyslenie: 200 ul kyseliny mravčej! 44!

Materiál a metódy Obr. 13: Experimentálne nastavenie pokusu s výsadbou, (pohľad: rastliny kukurice v nádobách Kick/Brauckmann pod kultivačnou lavičkou) Materiál Kick/Brauckmann nádoby: 16 kusov (Ø = 22 cm) Kompletné hnojivo: približne 3 g modrého zrna (ENTEC, COMPO) Jadrá kukurice: 12 ks PR39K13 (Early Star, Baiano) Váhy: Mettler Toledo G5002-2 Suchá váha: Mettler Toledo HB43-S Halogén Iné: hliníková fólia, odmerka, ručná lopatka, skladací meter! 46!

Materiál a metódy 2.8.2 Odber vzoriek rastlín Pokus sa ukončil po približne 80 dňoch. Zaznamenala sa celková hmotnosť testovacej zostavy, hmotnosť Kick/Brauckmann nádob, nadzemných (stonky a listy) a podzemných častí rastlín a hmotnosť pôdy. Rizosféra bola vystavená zhruba iba drvením drobkov pôdy prstami. Pôda sa oddelila od zvyšných malých a jemných koreňov preosievaním (