Dizertačná práca. získať akademický titul doktor Agriculturarum (Dr. agr.) od diplomovaného poľnohospodárskeho inžiniera Peter Škufca

1 Z Inštitútu pre výživové vedy (riaditeľ: prof. Dr. habil K. Eder) poľnohospodárskej fakulty (dekan: prof. Dr. agr. Habil W. Merbach) Univerzity Martina Luthera v Halle-Wittenberg Experimentálne štúdie o vplyve oxidovaných tukov o vybraných parametroch metabolizmu hormónov štítnej žľazy a lipidov u modelových zvieracích potkanov Dizertačná práca na získanie akademického titulu doktor polnohospodárstva (Dr. agr.) od absolventa poľnohospodárskeho inžiniera Peter Škufca urn: nbn: de: gbv: [Halle/Saale 2002

2 Z Ústavu výživových vied Experimentálne výskumy vplyvu oxidovaných tukov na vybrané parametre metabolizmu hormónov štítnej žľazy a lipidov u modelových zvieracích potkanov Poľnohospodárska fakulta Univerzity Martina Luthera Halle-Wittenberg ako dizertačná práca na získanie akademického titulu doctor Agriculturarum (Dr. agr.) predstavil diplomovaný poľnohospodársky inžinier Peter Škufca narodený 6. júna 1971 v Ľubľane, Slovinsko Recenzent: 1. Prof. Dr. habil Eder 2. PD Dr. habil Brandsch 3. Prof. Dr. habil Jareis dekan: prof. Dr. agr. habil. Obrana W. Merbacha 1. júla 2002 Halle/Saale 2002

3 Obsah Zoznam tabuliek Zoznam tabuliek Zoznam použitých skratiek Strana I III IV 1 Úvod 1 2 Materiál a metódy Príprava testu Vyšetrovanie vplyvu oxidovaných tukov na metabolizmus lipidov a hormónov štítnej žľazy s rôznym prísunom selénu Zloženie stravy Analytické parametre Vyšetrovanie vplyvu oxidovaných tukov na 9 hormónov štítnej žľazy a metabolizmus lipidov s rôznym prísunom jódu Zloženie stravy Parametre analýzy Vyšetrovanie vplyvu rôzne tepelne upravených 13 tukov na koncentrácie hormónov štítnej žľazy s rôznymi prísadami vitamínu E Zloženie stravy Parametre analýzy Chov testovaných zvierat Získanie a spracovanie materiálu vzorky Získanie plazmy, erytrocytov a odstránenie orgánu Frakcia lipoproteínov Extrakcia pečeňového homogenátu a pečeňového cytosolu Analytické metódy Stanovenie tukových ukazovateľov pre Absc Odhad 20 stupňa oxidácie tukov Peroxidové číslo Kyselinové číslo 20

9 III Zoznam obrázkov Zoznam obrázkov Obrázok Obsah č. Page 1 Reakcia malondialdehydu s kyselinou tiobarbiturovou 21 (podľa Valenzuela, 1991) 2 Stanovenie času oneskorenia podľa Kleinvelda a kol. (1992) 32 3 Princíp nepriameho stanovenia aktivity glutatiónperoxidázy 33 4 Separácia produktov PCR pomocou elektroforézy na agarózovom géle 50 5 Folikuly štítnej žľazy v priereze 57 6 Mechanizmy pôsobenia oxidovaných tukov na hypotézu syntézy hormónov štítnej žľazy 81

16 5 2 Materiál a metódy 4,4% (hmotn.). Aby sa eliminovali účinky rozdielneho zloženia mastných kyselín v testovaných tukoch, bolo zloženie mastných kyselín v čerstvom slnečnicovom oleji upravené pridaním 20% sadla k vzoru mastných kyselín oxidovaného tuku. Kyselina linolová (18: 2 n-6) bola hodnota orientácie (54,1 g/100 g mastných kyselín) (tabuľka 1). Tabuľka 1: Charakterizácia tukov použitých v prvom experimente Štartovacie tuky Slnečnicový olej Bravčová masť Testovacie tuky Čerstvo oxidovaný Zdroj tuku [g/kg diéta] Slnečnicový olej Bravčová masť Teplota spracovania [C] Čas [týždne] Údaje o tuku Peroxidové číslo [meq O 2/kg tuku] 2,00-4, TBARS [µmol/kg tuku] 0,29-0,27 0,34 číslo kyslosti [mg KOH/g tuku] 0,55-0,57 1,44 zloženie mastných kyselín [g/100 g mastných kyselín] kyselina myristová (14: 0) 0, 1 1,6 0,4 0,1 kyselina palmitová (16: 0) 6,3 26,7 10,6 7,4 kyselina palmitolejová (16: 1) 0,1 2,3 0,5 0,1 kyselina stearová (18: 0) 4,0 16,8 6,7 4,7 kyselina olejová (18: 1) 22,0 38,5 25,4 26,4 kyselina linolová (18: 2 n-6) 65,8 9,3 54, 1 54,1 Kyselina arachidová (20: 0) 0,3 0,0 0,2 0,3 Kyselina eikozénová (20: 1) 0,3 0,8 0,4 0,3 Tokoferoly [mg/kg tuku] α-tokoferol all-rac-a-tokoferol-acetát (dotácia) ekvivalent a-tokoferolu [mg/kg], skratky: KOH, hydroxid draselný; TBARS, reaktívne látky s kyselinou tiobarbiturovou.

21 10 2 Materiál a metódy Tabuľka 6: Charakterizácia tukov použitých v druhom experimente Štartovacie tuky Testovacie tuky Slnečnicový olej Palmový olej Čerstvo oxidovaný Zdroj tuku [g/kg stravy] Slnečnicový olej Palmový olej Teplota spracovania [C] Čas [týždne] Údaje o tuku Peroxidové číslo [meq O 2/kg] 2, 0-4, TBARS [µmol/kg] 0,29-0,27 0,34 číslo kyslosti 0,59-0,61 1,30 zloženie mastných kyselín [g/100 g mastných kyselín] kyselina myristová (14: 0) 0,1 1, 2 0,2 0,1 kyselina palmitová (16: 0) 6,3 45,9 10,5 7,4 kyselina palmitolejová (16: 1) 0,1 0,2 0,1 0,1 kyselina stearová (18: 0) 4,4 4,5 4,4 4,7 kyselina olejová (18: 1) 22,4 37,7 24,3 26,9 kyselina linolová (18: 2 n-6) 66,2 9,5 59,8 60, 1 Kyselina arachidová (20: 0) 0,3 0,4 0,3 0,3 Kyselina eikozénová (20: 1) 0,2 0,2 0,2 0,3 Tokoferoly [mg/kg tuku] α-tokoferol, vše- rac-α-tokoferol acetát (doplnok) ekvivalent alfa-tokoferolu [mg/kg], skratky: TBARS, látky reagujúce s kyselinou tiobarbiturovou.

25 14 2 Materiál a metódy Tabuľka 10: Charakterizácia tukov použitých v treťom experimente Štartovací tuk Testovacie tuky FF Tuk # 1 Tuk # 2 Tuk # 3 Zdroj tuku [g/kg stravy] Slnečnicový olej Bravčová masť Teplota spracovania [C] Čas [hodiny] Peroxidačné produkty v tuku Peroxidové číslo [meq O 2/kg] 1,6 1,5 TBARS [μmol/kg] 0,08 0,13 10,3 2,18 0,29 zloženie mastných kyselín [g/100 g mastných kyselín] kyselina myristová (14: 0) 0, 8 1,1 0,9 1,0 0,9 kyselina palmitová (16: 0) 15,2 13,2 17,4 17,8 17,5 kyselina palmitolejová (16: 1) 1,5 1,3 1,6 1,6 1,5 kyselina stearová (18: 0) 8,7 11,5 9,8 10,4 10,2 kyselina olejová (18: 1) 33,4 35,6 36,9 35,6 34,7 kyselina linolová ( 18: 2 n-6) 36,6 26,1 26,9 26,6 27,2 kyselina linolénová (18: 3 n-3) 0,5 0,6 0,3 0,3 0,3 kyselina eikozénová (20: 1) 0,7 0,8 0,7 0,7 0,8 Tokoferoly [mg/kg tuku] a-tokoferol (analyzovaný), 9 nízky doplnok all-rac-α-tokoferolacetátu - 71, zvýšený ekvivalent α-tokoferolu [[ mg/kg tuku] (vypočítané) Nízky prídavok Zvýšený prídavok Skratky: FF, Čerstvý tuk; Tuk č. 1, tuk zahriaty na 50 ° C, tuk č. 2, tuk zahriaty na 105 ° C; Tuk č. 3, tuk zahriaty na 190 ° C; TBARS, reaktívne látky s kyselinou tiobarbiturovou.

27 16 2 Materiál a metódy Tabuľka 11: Zloženie stravy na tretí pokus Tuková zložka čerstvá Množstvo [g/kg] Oxidované množstvo [g/kg] Kazeínový škrob Sacharóza Čerstvý tuk: Slnečnicový olej Bravčová masť * 50 * Celulóza Vitamín premix Minerálny premix DL-metionín 2 2 * obsah slnečnicového oleja a sadla pre oxidované tuky (tuk č. 1, tuk č. 2 a tuk č. 3). 1 vitamínová premix na kg stravy: 4 000 I.U. retinol; 1 000 IU cholekalciferolu; 0,75 mg menadionu bisulfidu sodného; 5 mg tiamín hydrochloridu; 6 mg riboflavínu; 6 mg hydrochloridu pyridoxínu; 15 mg Ca-D pantotenátu; 30 mg kyseliny nikotínovej; 2,0 mg kyseliny listovej; 0,025 mg kobalamínu; 0,2 mg biotínu; 1 000 mg cholínchloridu, sila 16,9 g. 2 minerálne premixy na kg stravy: 9,83 g uhličitanu vápenatého; 9,42 g di-fosforečnanu vápenatého; 4,87 gramov fosforečnanu horečnatého; 10,0 gramov síranu draselného; 0,87 g oxidu horečnatého; 2,99 g chloridu sodného; 0,16 g síranu železitého; 50,6 mg oxidu zinočnatého; 30,0 mg pentahydrátu síranu meďnatého; 24,2 mg oxidu manganičitého; 0,32 mg jodičnanu vápenatého; 0,33 mg seleničitanu sodného, sacharózy 1,8 g.

28 17 2 Materiál a metódy Tabuľka 12: Koncentrácie α-tokoferolu v použitých diétach a klasifikácia testovacích skupín v treťom teste Skupina Typ tuku α-tokoferol acetát α-tokoferol vitamín E Analyzovaná skratka Skupina [mg/kg diéta] [mg/kg diéta] I II čerstvé žiadne 11,6 ± 0,95 25 FF/NE (25 mg/kg diéta) ± 38,1 250 FF/EE III oxidované 25 46,5 ± 2,21 25 OF # 1/NE pri IV 50 C ± 30, 4 250 OF # 1/EE V oxidované 25 25,4 ± 4,17 25 OF # 2/NE pri VI 105 C ± 40,5 250 OF # 2/EE VII oxidované 25 26,7 ± 1,64 25 OF # 3/NE pri VIII 190 C ± 7, OF # 3/EE Skratky: FF, čerstvý tuk; OF # 1, tuk zahriaty na 50 ° C; OF # 2, tuk zahriatý na 105 ° C; OF # 3, tuk zahriatý na 190 ° C; EE, zvýšený prísun vitamínu E; NE, nízky prísun vitamínu E. Tabuľka 13: Hodnoty tukov v strave z tukov v treťom experimente ako súčasť hotovej stravy Skupina POZ [meq O 2/kg tuku] TBARS [mmol/kg tuku] I 4,66 0,02 II 4,41 0,00 III, 7 IV, 1 V 329 2,21 VI 224 2,26 VII 39,2 0,15 VIII 37,7 0,21 Skratky: POZ, peroxidové číslo; TBARS, reaktívne látky s kyselinou tiobarbiturovou.

32 21 2 Materiál a metódy Výpočet čísla kyslosti: AN (mg KOH/g) = 56,1. Spotreba KOH (ml). Koncentrácia KOH (N) Hmotnosť tuku (g) Látky reagujúce s kyselinou tiobarbiturovou Stanovenie TBARS bolo založené na metóde Sidwell et al. (1954), modifikované autormi Halliwell a Gutteridge (1989) a Valenzuela (1991). Toto stanovenie je založené na reakcii dvoch molekúl kyseliny tiobarbiturovej (TBA) a jednej molekuly malondialdehydu (MDA) vplyvom tepla v kyslom prostredí (obrázok 1). OH CHO OOH N 2 x + CH2 HN NH HS N OH CHO SN OH O NH S TBA MDA Obrázok 1: Reakcia malondialdehydu s kyselinou tiobarbiturovou (podľa Valenzuela, 1991) Na stanovenie množstva TBARS sa použije kalibračná krivka s 1,1, 3,3-Tetraetoxypropán (TEP) vytvorený ako štandard. 0,2 g tuku alebo 0,2 ml štandardu sa zmiešalo so 4 ml chloroformu a 4 ml činidla TBA (0,67% (hmotn./obj.)) V destilovanej vode, zriedilo sa 1: 2 ľadovou kyselinou octovou) a pretrepávalo sa 4 minúty. Po oddelení fáz sa horná vodná fáza odpipetuje a zahrieva sa 30 minút na 95 ° C. Potom sa zmerala absorpcia pri 532 nm v sklenených kyvetách. Množstvo TBARS v μmol bolo stanovené pomocou kalibračnej krivky a vztiahnuté na 1 kg tuku.

36 25 2 Materiál a metódy Priemer folikulov a výšky epitelu sa potom merali na digitalizovaných obrázkoch, ktoré sa zaznamenali farebnou videokamerou Sony 3CCD na Axioscope pri 200-násobnom zväčšení (Zeiss, Jena, Nemecko). Na jedno sklíčko sa zmeralo 30 priemerov folikulov a výška troch asociovaných epitelových buniek (Seffner a Heller, 1979; Seffner, 1982). Hodnotenie sa uskutočňovalo pomocou hodnotiaceho programu KS (Zeiss, Jena, Nemecko). Tabuľka 14: Schéma zapustenia do zalievacieho stroja Fázy zabudovania Čas vloženia (hodiny) 1 Etanol 70% I 1 2 Etanol 70% II 1 3 Etanol 80% 1 4 Etanol 90% 1 5 Etanol 96% I 1 6 Etanol 96% II 1 7 Etanol abs. I 1 8 etanol abs. II 1 9 Xylén I 1 10 Xylén II 1 11 Parafín I 2 12 Parafín II Aspoň 1 Tabuľka 15: Odstránenie zalievacieho činidla Krok odstránenia Odstránenie Trvanie (min) 1. Xylén II Odstránenie parafínu 5 2. Xylén II Odstránenie parafínu obsahujúceho xylénu 5 3. Xylén III Odstránenie posledných stôp parafínu 5 4. Xylén: Etanol abs. 1: 1 (obj./obj.) Odstránenie xylénu 1 5. Etanol abs. I Odstránenie xylénu 5 6. Etanol abs. II Eliminácia zvyškov xylénu 5 7. Etanol abs. III Odstránenie zvyškov xylénu 5 8. Etanol 96% 1 9. Etanol 80% voda (deionizovaná) Vymeňte niekoľkokrát 5

40 29 2 Materiály a metódy Peroxidáza štítnej žľazy. Parametre reakcie sú uvedené v tabuľke 18. Tabuľka 18: Parametre RT-PCR pre sekvencie párov párov primérov a štítnej peroxidázy TPO (EMBL ID: RNTPO) Primér 1 5 CCA CAA AAG GCC GAG GTT CAA G 3 Primér 2 5 AAG GGC TGT GGC ATT TAT TCG TCT 3 Koncentrácia priméru syntéza cdna (Redy To Go TM RT-PCR Beads, Amersham Pharmacia) GAPDH (EBMI ID: RNGAPDHR) Primer 1 5 GCA TGG CCT TCC GTG TTC C 3 Primer 2 5 GGG TGG TCC AGG GTT TCT TAC TC 3 TPO - zmes 1,0 páru/μl priméru GAPDH - 1,0 pmol/ul zmesi párov primérov 34 ul ultračistej vody bez RNAsy 1 ul Oligo pd (T) (12-18) (0,5 ug/ul) 5 ul vzorky RNA (0,2 ug/ul) Šarže boli zmiešané a cdna sa syntetizovala za 25 minút pri 42 ° C. Potom bola cdna 4,5 minúty denaturovaná pri 95 ° C. PCR reakcia (Pharmacia) (Redy To Go TM RT-PCR Beads, Amersham Pharmacia) 40 ul denaturovanej reakčnej zmesi (syntéza cdna) 5 ul zmesi párov párov TPO 5 ul zmesi párov párov GAPDH Šarže sa zmiešali a uskutočňovali počas 42 cyklov (95 ° C, 30 sekúnd). Vykonala sa denaturácia; 60 ° C, 30 s. Pripojenie primeru; 72 ° C, 45 s. Amplifikácia primeru. Skratky: GAPDH, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza; TPO, peroxidáza štítnej žľazy; EMBL ID, identifikačné číslo sekvencie mrna v Európskom laboratóriu molekulárnej biológie.

43 32 2 Materiál a metódy Parametre systému antioxidačnej ochrany Koncentrácia α-tokoferolu v plazme a pečeni bola stanovená ako parameter systému antioxidačnej ochrany. Čas oneskorenia sa určil ako parameter oxidačnej citlivosti LDL. Ďalej bola stanovená aktivita GSH-Px obsahujúceho selén v pečeňovom cytozole a aktivita superoxiddismutázy (SOD) v erytrocytoch. Stanovenie koncentrácie α-tokoferolu v plazme a pečeni Za predpokladu 0,05 g pečene a 200 ul plazmy, koncentrácia α- tokoferoly podľa metódy Balza a kol. (1993) a Coors (1991) stanovené (pozri kapitolu 2.3.2) Oxidačná citlivosť lipoproteínov s nízkou hustotou Oxidačná citlivosť LDL bola stanovená ako časová oneskorenie na základe metódy Esterbauera a kol. (1989) stanovené. Čas oneskorenia je definovaný ako interval (min.) Medzi začiatočným bodom merania a priesečníkom priamky (a) počiatočnej absorpcie a dotyčnice (b) v oblasti lineárneho nárastu absorpčnej krivky (Kleinveld a kol., 1992) ( Obrázok 2). 1,0 Absorbancia pri 234 nm 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Čas oneskorenia [min] Obrázok 2: Stanovenie času oneskorenia podľa Kleinvelda a kol. (1992)

49 38 2 Materiál a metódy boli zahájené. Všetky testovacie médiá sa pred stanovením zahriali na teplotu 25 ° C a potom sa na spektrometri (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) meralo zvýšenie extinkcie pri 339 nm a 25 ° C počas 1 minúty. Slepá hodnota sa použila na korekciu hodnôt vzorky; určila sa nešpecifická tvorba NADPH/H + bez pridania malonyl-CoA a odpočítala sa od hodnoty vzorky. Aktivita FsS bola vypočítaná pomocou rovnice opísanej v kapitole Stanovenie relatívnej koncentrácie mrna lipogénnych enzýmov v pečeni. Celková RNA bola stanovená pomocou metódy guanidíniumtiokyanátu podľa Chirgwin et al. (1979) modifikovaný podľa Chomaczynski a Sacchi (1987) s reagentom RNAzol B (WAK Chemie Medical, Bad Soden, Nemecko), izolovaný. Priméry G6PDH, FsS a GAPDH boli stanovené na základe metódy Köhlera (1995) a boli vykonané kinetické štúdie (pozri kapitolu).