Glomerulárny rast ako test Ex Vivo na analýzu ciest zapojených do parietálnej epiteliálnej bunky

Zhrnutie

Tento článok popisuje spôsob kultivácie a analýzy výrastkov glomerulárnych parietálnych epiteliálnych buniek z enkapsulovaných glomerulov izolovaných z myšej obličky. Táto metóda môže byť použitá na štúdium ciest zapojených do proliferácie a migrácie buniek parietálneho epitelu.

Abstrakt

Úvod

Glomerulárne choroby sú dôležitou skupinou chorôb obličiek a sú hlavnou príčinou chorôb obličiek v konečnom štádiu (ESRD). Bohužiaľ, konkrétne možnosti liečby sú obmedzené a prechod na ESRD je nevyhnutný. Glomerulárne choroby sú definované prítomnosťou glomerulárnych poranení a možno ich rozdeliť na zápalové a nezápalové ochorenia. Aj keď je počiatočná urážka odlišná, nedávne štúdie ukázali, že spoločný bunkový mechanizmus vedie k hyperplázii glomerulárnych epiteliálnych buniek a nakoniec ku glomeruloskleróze u všetkých glomerulárnych chorôb bez ohľadu na základnú príčinu 1, 2, 3, 4 .

Ukázalo sa najmä, že glomerulosklerotické lézie pozostávajú hlavne z aktivovaných parietálnych epitelových buniek 5, 6. Za fyziologických podmienok sú parietálne epitelové bunky ploché, spiace epitelové bunky, ktoré lemujú Bowmanovu kapsulu glomerulu. Aktivácia parietálnych epiteliálnych buniek však môže vyvolať akékoľvek glomerulárne poškodenie, či už v dôsledku genetických mutácií (napr. Podocytových alebo mitochondriálnych cytopatií), zápalu alebo hyperfiltrácie (napr. Spôsobené znížením množstva obličiek, vysokým krvným tlakom, obezitou alebo diabetickým mellitom). . Aktivované parietálne epiteliálne bunky sa množia a ukladajú extracelulárnu matricu, čo vedie k tvorbe bunkových polmesiacov alebo sklerotickým léziám 5, 7, 8. Progresia týchto procesov vedie k strate funkcie obličiek 9. Preto je aktivácia parietálnych epiteliálnych buniek kľúčovým faktorom pri vývoji a progresii glomerulosklerózy pri zápalových a nezápalových glomerulárnych ochoreniach 1, 2, 3, 4, 10 .

Molekulárne procesy, ktoré sprostredkúvajú aktiváciu parietálnych epitelových buniek, sú stále do veľkej miery neznáme. Posledné štúdie ukazujú, že aktivované parietálne epiteliálne bunky de novo EXPRESS CD44, receptor, ktorý sa podieľa na aktivácii rôznych dráh v bunkovej proliferácii a migrácii. Okrem toho sa ukázalo, že inhibícia CD44 inhibuje aktiváciu aktivácie parietálnych epiteliálnych buniek a zmierňuje progresiu tvorby polmesiaca a glomerulosklerózy na zvieracích modeloch zápalových aj nezápalových glomerulárnych chorôb 11, 12.

Pretože aktivácia parietálnych epitelových buniek je dôležitým činiteľom vo vývoji glomerulosklerózy a tvorby polmesiaca, inhibícia týchto buniek by mohla spomaliť progresiu glomerulárnych chorôb. Objasnenie molekulárnych dráh, ktoré riadia aktiváciu parietálnych epiteliálnych buniek, môže viesť k vývoju špecifických terapeutických intervencií, ktoré zmierňujú tvorbu hyperplastických a glomeruloclerotických lézií pri glomerulárnych ochoreniach.

Na experimentálnych zvieracích modeloch je často ťažké poskytnúť dôkazy o priamom účinku zmenenej génovej expresie (knock-out modely alebo modely transgénnych myší) alebo o liečbe liekom na parietálne epitelové bunky. U konvenčnej knock-out myši sa pozorované zmeny in vivo dajú vysvetliť priamymi zmenami v parietálnych epitelových bunkách. Pretože sa však génová expresia mení aj v iných bunkových typoch myši, nemožno vylúčiť nepriame účinky sprostredkované inými bunkovými typmi. Vývoj podmienených myší Cre-Lox poháňaných promótormi, ktoré sú primárne aktívne v parietálnych epitelových bunkách, priniesol v niektorých prípadoch riešenie pre 13. Podmienené transgénne modely sú však zložité a zatiaľ čo sú stále k dispozícii viac podmienených línií, mnoho tradičných vyraďovacích alebo transgénnych myších línií stále nie je podmienene nahradených.

Na štúdium priamych účinkov na parietálne epitelové bunky vyvinula naša skupina test ex vivo s použitím jednotlivých enkapsulovaných glomerulov izolovaných z obličiek myší na meranie a analýzu proliferácie a migrácie parietálnych epiteliálnych buniek. Táto metóda nám umožní určiť špecifické účinky na parietálne epiteliálne bunky a nájsť zodpovedné cesty pre aktiváciu buniek parietálneho epitelu a otestovať možnosti liečby na inhibíciu tejto aktivácie.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočňovali v súlade s pokynmi Výboru pre etiku zvierat na Radboudskej univerzite v Nijmegene.

POZNÁMKA: Neliečené zdravé myši divokého typu (n = 4) a cd44 -/- (n = 4) myši boli utratené vo veku 12 až 16 týždňov. Boli použité samce aj samice myší. Všetky myši boli na pozadí C57Bl/6.

1. Obetujte zdravé myši WT alebo geneticky modifikované myši dislokáciou krčka maternice.
2. Okamžite po usmrtení myší rozoberte celé obličky myši. Za týmto účelom urobte strednú laparotómiu brušnými nožnicami, prerežte pokožku a potom brušné svaly. Vyberte črevo a umiestnite ho vedľa myši.
3. Oslobodte obličky od spojenia s tkanivami a vytiahnite ich obličkami chirurgickými kliešťami, nožnicami prerežte obličkovú tepnu, obličkovú žilu a močovod.
4. Vyberte obličkové kapsuly z obličiek tak, že ich držíte chirurgickými kliešťami a kapsulu odlepte pomocou ďalších párov klieští.
5. Pripravte obličky na 6-jamkovú doštičku na kultiváciu buniek (2 obličky/jamku) s 2 ml Von Hanksovho vyváženého soľného roztoku (HBSS) na jamku a vložte ju na ľad.

2. Izolácia glomerulov z myšej obličky

3. Kultivácia glomerulárneho výrastku

4. Analýza proliferácie parietálnych epiteliálnych buniek

5. Charakterizácia rastu glomerulárnych buniek

POZNÁMKA: Na stanovenie bunkového zloženia výrastku sa na glomerulárnych výrastkoch uskutoční imunofluorescenčné farbenie pre bunkovo ​​špecifické markery v čase t = 6 dní.

1. Opatrne odstráňte médium a dvakrát jemne umyte glomeruly fosfátom pufrovaným soľným roztokom (PBS).
2. Fixujte 10 minút pri izbovej teplote 2% (hmotn./obj.) Paraformaldehydom (PFA) doplneným 4% (hmotn./obj.) Sacharózou v PBS a opatrne dvakrát premyte PBS.
3. S primárnou protilátkou s príslušnou koncentráciou (Materiálová tabuľka) Inkubujte v PBS-ovinovom sérovom albumíne (BSA) 1% (v/v) po dobu 1 hodiny pri izbovej teplote.
4. Odstráňte roztok protilátky a opatrne 3x premyte PBS.
5. Inkubujte so sekundárnou protilátkou (Materiálová tabuľka) zriedený v PBS-BSA 1% (obj./obj.) v tme po dobu 45 minút pri teplote miestnosti.
6. Opatrne 3x premyte PBS a zmiešajte s 1-2 kvapkami vodného montážneho média s 4,6-diamidino-2-fenylindolom (DAPI), aby ste vizualizovali jadrá, a jamku zakryte guľatým viečkom.
7. Fotografujte mikroskopické obrázky pomocou fluorescenčného mikroskopu.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Obrázok 1: Schematický prehľad metódy na uskutočnenie testu glomerulárneho výrastku na analýzu proliferácie epiteliálnych buniek. (1) Z obetovanej myši sa odoberú obličky a rozdrvia sa na malé kúsky. (2) Obličkové tkanivo sa pretlačí cez sito 300 m a prepláchne sa cez sitá 75 ma 53 m. (3) Glomeruly zostávajúce na sitách sa zhromaždia so stredným + 20% (v/v) FCS a prenesú sa na ultranízku montážnu dosku. (4) Jednotlivé glomeruly sa zhromaždia pomocou mikroskopu s obráteným svetlom a prenesú sa na 24-jamkové kultivačné platne. (5) Po inkubácii pri 37 ° C, 5% (obj./obj.) CO2 po dobu 6 dní, je možné glomerulárny výrastok analyzovať digitálnym mikroskopom s obráteným svetlom. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 2: Glomerulárny rast izolovaných enkapsulovaných glomerulov z obličiek rozrezaných WT myšami. Rast zapuzdrených glomerulov inkubovaných pri 37 ° C je indikovaný v rôznych časoch: (A.) 0 dní, (B.) 2 dni, (C.) 4 dni a (D.) 6 dní. Boli tiež izolované dekapitulované glomeruly a kultivované pri 37 ° C a boli urobené mikroskopické obrázkyDeň0 a (F.) Deň 6, ktorý nevykazoval žiadne rastúce bunky. Mierka: (A, E, F) 200 'm, (B.) 400 'm, (CD) 1 000 m. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 3: Rastúce glomerulárne bunky ukazujú expresiu markeru parietálnych epitelových buniek. Imunofluorescenčné farbenie sa uskutočnilo 6. deň po izolácii jednotlivých enkapsulovaných glomerulov, aby sa charakterizovali prerastené epitelové bunky. Rastúce bunky pozitívne zafarbené na markery parietálnych epiteliálnych buniek: (A.) CD44, (B.) SSeCKS a (C.) claudín-1, ale nevykazoval žiadnu expresiu (D.) markér špecifický pre podocyty synaptopodín alebo (E.) marker špecifický pre endoteliálne bunky CD31, ktorý sa nachádzal výlučne v glomerule. Mierka: (A, B, D, E) 100 'm, (C.) 50 'm. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 4: Glomerulárny rast je narušený v glomeruloch izolovaných z CD44 knockoutovaných myší. Zapuzdrené glomeruly sa získali z disekovaných obličiek z (A.) WT myši a (B.) cd44 -/- myši izolované. Mikroskopické obrázky boli urobené digitálnym mikroskopom s obráteným svetlom po 6 dňoch kultivácie. Počet prerastajúcich parietálnych epitelových buniek a povrchová plocha rastu boli zvýšené v glomeruloch WT myší v porovnaní s cd44 -/- myšami, čo naznačuje dôležitú úlohu CD44 pri aktivácii parietálnych epitelových buniek. Mierka: 1 000 m. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Obrázok 5: Príklad analýzy povrchu glomerulárneho výrastku ako markeru pre proliferáciu parietálnych epitelových buniek pomocou ImageJ (FIJI). (A.) Glomerulárny výrast zapuzdreného glomerulu myši WT po 6 dňoch kultivácie pri 37 ° C. (B.) Najskôr sa určí stupnica, aby sa mohol analyzovať povrch v mm 2. Tu: 1 mm = 460 pixelov. (C.) Po nastavení mierky sa okolo oblasti glomerulárneho výrastku nakreslí čiara výberu. (D.) Túto vybranú oblasť je potom možné zmerať (povrch v tomto príklade = 2 235 mm 2). Mierka: 1 000 m. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Pomocou protokolu opísaného v tomto článku je možné použiť jednotlivé enkapsulované glomeruly na vyhodnotenie proliferácie parietálnych epiteliálnych buniek, ktoré je dôsledkom aktivácie parietálnych epiteliálnych buniek. Tento model ex vivo nám umožní podrobne študovať molekulárne dráhy zapojené do aktivácie parietálnych epiteliálnych buniek. Popísaná metóda je založená na jednoduchom koncepte disekcie obličiek a preosievania na izoláciu a kultiváciu zapuzdrených glomerulov a na porovnaní proliferácie a/alebo migrácie buniek parietálneho epitelu za rôznych experimentálnych podmienok. Výsledky, ktoré je možné v kultúre analyzovať po 6 dňoch, sú napríklad povrchová plocha alebo priemer výrastku alebo počet prerastajúcich buniek jedného kapsulového glomerulu. Ďalšou aplikáciou tohto testu by mohlo byť štúdium účinkov liekov, ktoré indukujú alebo inhibujú molekulárne dráhy, ktoré sa môžu podieľať na aktivácii parietálnych epiteliálnych buniek.

Imunofluorescenčné farbenie potvrdilo, že vyrastajúce bunky sú parietálne epitelové bunky po 6 dňoch v kultúre, pretože boli pozitívne zafarbené na markery parietálnych epitelových buniek (CD44, klaudín-1, SSeCKS), ale neexprimovali ani podocytový špecifický marker, synaptopodín ani markér endotelových buniek CD31. V súlade s výsledkami farbenia nebolo možné pozorovať žiadne vyrastajúce bunky 6 dní po izolácii a kultivácii jednotlivých dekampulovaných glomerulov, čo naznačuje, že v tomto 6-dňovom období existuje obmedzená kontaminácia ďalších glomerulárnych buniek. Ďalšia štúdia tiež analyzovala glomerulárny rast a ukázala, že rýchlo rastúce bunky odvodené z glomerulárneho rastu boli skutočne odvodené z parietálnych epitelových buniek 14.

Protokol farbenia použitý na analýzu expresie markera vyrastajúcich buniek sa môže tiež prispôsobiť ďalším požadovaným molekulám. Imunologické farbenie sa uskutočňovalo v jamkách doštičiek, v ktorých sa glomeruly inkubovali 6 dní. Tieto jamky neboli pokryté počas prvých 2 - 3 hodín inkubácie, ale ku jamkám boli pripojené glomeruly. Inkubácia na sklenených vložkách alebo systéme posuvných komôr, ktorá by viedla k lepšiemu zobrazovaniu, nebola možná, pretože glomeruly neboli úplne pripevnené k povrchu a bol narušený rast glomerulov. Tento špecifický protokol bol nedávno zavedený na štúdium rastu temenných epitelových buniek z glomerulov od zdravých myší WT a cd44 -/- 11. Pomocou tejto metódy sa ukázalo, že CD44-deficídne parietálne epitelové bunky majú zníženú rýchlosť proliferácie, čo je tiež znázornené na obrázku 4.sa zobrazí. Túto metódu možno použiť aj pre myši iných kmeňov a tiež pre ďalšie geneticky modifikované myši. Napríklad predchádzajúca štúdia použila podobný prístup na analýzu účinkov signalizácie glukokortikoidových receptorov 15.

Použitie tejto techniky na izoláciu glomerulov z myší a analýzu bunkových výrastkov má mnoho výhod oproti použitiu udržiavaných parietálnych epitelových bunkových línií na analýzu dráh zapojených do aktivácie parietálnych epitelových buniek alebo liekov, ktoré bránia procesu Môže ovplyvniť proliferáciu epiteliálnych buniek. V prvom rade táto metóda využíva primárne bunky, ktoré rastú priamo z glomerulu a sú v kultúre iba 6 dní. Preto parietálne epitelové bunky z glomerulárnych výrastkov zaznamenali menej zmien vo fenotype ako večné bunkové línie, ktoré si na produkciu bunkovej línie 16 vyžadujú ďalšie rastové pasáže. Tu opísanú metódu je možné navyše použiť na porovnanie účinku špecifických knockoutov génov na proliferáciu parietálnych buniek aj pre cesty, ktoré je ťažké umlčať do bunkových línií z dôvodu zhoršeného bunkového rastu alebo účinnosti GenKnockout pomocou metód tlmenia.

Aby sa protokol prispôsobil iným zvieracím modelom alebo ľudskému obličkovému tkanivu, mala by sa veľkosť sita optimalizovať pre najlepší výsledok. Je to tak preto, lebo veľkosť glomerulov sa medzi jednotlivými druhmi líši, a preto sa veľkosť sít, na ktorých je možné glomeruly zbierať, líši. Na účely tejto metódy je tiež dôležité izolovať neporušené, zapuzdrené glomeruly. Preto by glomeruly nemali byť vytlačené, ale jemne prepláchnuté cez menšie sitá.

Ďalším dôležitým krokom v protokole je zber zapuzdrených glomerulov po preosiatí. Tu je dôležité použiť médium s 20% FCS, aby sa zabránilo vzájomnému spojeniu glomerulov. Okrem toho by mal byť roztok obohatený o glomeruly prevedený priamo na ultranízko adhézne doštičky, inak sa glomeruly pripevnia priamo na povrch bežných doštičiek na kultiváciu buniek a dokonca aj na povrch plastových skúmaviek, čo sťažuje detekciu a izoláciu jednotlivých glomerulov.

Po zhromaždení jednotlivých enkapsulovaných glomerulov by sa mali kultivovať 3 hodiny v malom objeme kultivačného média v strede jamky, aby sa umožnila adhézia. Glomeruly by nemali plávať v smere doskovej čiary jamiek, aby sa optimalizovalo načítanie počas analýzy obrazu.

Na dosiahnutie najlepších výsledkov tu opísaným protokolom odporúčame kultivovať jednotlivé glomeruly a vykonať odpočet 6. deň. V tomto okamihu je možné pozorovať homogénny bunkový výrastok pozostávajúci z parietálnych epiteliálnych buniek. V neskorších dobách sa glomerulárny výrast stáva fenotypicky heterogénnym, čo naznačuje rast ďalších typov buniek. Preto sa protokol nezdá byť vhodný pre veľmi dlhé inkubačné časy. Je potrebné poznamenať, že inkubačné časy pre rast parietálnych epitelových buniek sa môžu líšiť medzi druhmi alebo medzi rôznymi kmeňmi myší. Preto by sa mali kultivačné časy testovať a optimalizovať pre každý kmeň alebo druh myši. Okrem toho by sa mal pôvod glomerulárneho výrastku vždy overiť vyfarbením markerov špecifických pre parietálne epitelové bunky.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

---