HPLC analýza optimalizácie metódy vitamínu C a tvorba referenčných hodnôt - PDF zadarmo

Z centrálneho laboratória kampusu Lübeck lekárskeho centra Univerzity Šlezvicko-Holštajnsko vedúci: prof. Dr. med . Seyfarth a lekárska fakulta univerzity v Lübecku dekan: Prof. Dr. med . Solbach HPLC analýza vitamínu C: optimalizácia metód a tvorba referenčných hodnôt Úvodná dizertačná práca na získanie doktorátu na univerzite v Lübecku - z lekárskej fakulty - prezentovaná Corneliou arlene Focke z Bremen Lübeck 2010 1

analýza

1. Spravodajca: prof. Dr. med. ichael Seyfarth 2. spravodajca: Priv.-Doz. DR. med. Deň ústnej skúšky Gunther Eitz: 9. 6. 2010 Schválené pre tlač. Lübeck, 6. septembra 2010 podpísali prof. Dr. med. erner Solbach - dekan lekárskej fakulty 2

jesť to, čo je merateľné. (Galileo Galilei) 3

2.2.8 Štúdie o stabilite vzoriek. 31 2.2.9 Optimalizované metódy HPLC na stanovenie kyseliny askorbovej v sére a plazme. 32 2.2.10 Vyšetrenia moču a alkoholu vitamín C. 32 2.3 Validácia metódy. 33 2.3.1 Skúšky správnosti. 33 2.3.2 Presné štúdie. 33 2.3.3 Vyšetrovanie týkajúce sa limitu detekcie a kvantifikácie. 34 2.3.4 Vyšetrovania týkajúce sa linearity merania. 34 2.4 Aplikácia metód: stanovenie referenčných hodnôt a štúdie kinetiky vitamínu C. 34 2.4.1 Referenčné hodnoty. 34 2.4.2 Kinetika. 35 2.5 Štatistické metódy. 35 3. Výsledky. 37 3.1 Optimalizácia a validácia metódy. 37 3.1.1 Stacionárna fáza. 37 3.1.2 Obilná fáza. 37 3.1.3 Interný štandard. 40 3.1.4 Správnosť. 40 3.1.5 Presnosť. 41 3.1.6 Detekčný limit. 41 3.1.7 Lineárny jedálenský kút. 42 3.1.8 Stabilita vzoriek vitamínu C. 42 3.1.9 Meranie vzoriek moču a likvoru. 46 3.2 Uplatňovanie metód. 47 3.2.1 Stanovenie referenčnej hodnoty. 47 3.2.1.1 Skúmanie rozdielov špecifických pre vek. 49 3.2.1.2 Skúmanie rodovo špecifických rozdielov. 51 3.2.2 Kinetika vitamínu C. 53 4. Diskusia. 56 4.1 optimalizácia metódy. 56 4.2 Limity metódy. 58 4.3 Referenčné hodnoty. 58 4.4 Kinetika. 59 4.5 Možné použitia. 60 4.6 Výhľad. 60 5

5. Zhrnutie. 61 6. Príloha. 62 Bibliografia. 67 Poďakovanie. 80 životopisov. 81 Vyhlásenie o nezávislosti a vyhlásenie o žiadosti. 82 6

Zoznam skratiek Obr. Obrázok Destilovaná voda Aqua deň ECD elektrochemická detekcia EDTA kyselina etyléndiamíntetraoctová HPLC vysokoúčinná kvapalinová chromatografia I.U. medzinárodné jednotky i.v. intravenózne kg kg kg telesnej hmotnosti l liter LDL lipoproteín s nízkou hustotou mg Illigramm min. inute ml Illiliter µmol ikromol mmol Illimol PA kyselina metafosforečná na nanoampére č. Počet pavk periférne arteriálne okluzívne ochorenie PCA kyselina chloristá rp HPLC HPLC s reverznými fázami RT RT teplota miestnosti pozri kartu SD štandardná odchýlka. Tabuľka U otáčky UV ultrafialové V volty VK variačný koeficient 7

Navyše prostredníctvom rozhrania, ktoré umožňuje kontrolu systému a zaznamenávanie a vyhodnocovanie nameraných údajov počítačom. Obrázok 5: Znázornenie systému HPLC s mobilnou fázou (rozpúšťadlo), čerpadlom, vstrekovacím systémom (injektor), kolónou (HPLC kolóna), detektorom (detektorom), odpadom (aste) a pripojeným počítačom na vyhodnotenie údajov (údaje) ( http://www.chemistry.nmsu.edu/instrumentation/aters_hplcsystem.gif). Pretože sú zlúčeniny zadržiavané na pevnej fáze počas rôznych časových období (retenčný čas), je možné látky identifikovať, to znamená kvalitatívnou analýzou. Na chromatograme umožňuje grafické znázornenie signálu detektora (os y) proti času (os x), výška vychýlenia, takzvaný vrchol, tiež stanovenie koncentrácie, to znamená kvantitatívnu analýzu, pomocou výpočtu výšky alebo plochy. Obr.6: Príklad chromatogramu. Miera vychýlenia (os y) sa vynesie proti času (os x) (retenčný čas). A a B ukazujú dva vrcholy rôznych výšok. 20

Systematické skúmanie stability vzoriek v rôznych médiách. Vytváranie referenčných hodnôt pre rôzne vekové skupiny. Výskum kinetiky vitamínu C u zdravých dobrovoľníkov. Ďalej je potrebné skontrolovať, či je optimalizovaná metóda zásadne vhodná aj na stanovenie vitamínu C v iných biologických tekutinách, najmä v moči. a mozgovomiechový mok. 26

2. Materiál a metódy 2.1 Vybavenie, skúšobné materiály, chemikálie 2.1.1 Zariadenie Systém HPLC: Inteligentné čerpadlo L-6220 (erck Hitachi) Rozhranie D-6000A (erck Hitachi) Autosampler AS-2000A (erck Hitachi) Degasser (Knauer) L- 4250 UV-VIS detektor (erck Hitachi) Amperometrický detektor L-3500A (erck recept) HPLC kolóna a ochranná kolóna: Synergi 4 µm Hydro-RP 80A 150 x 4,6 mm (Phenomenex 00F-4375-E0) Sada bezpečnostných kaziet GuardGuard, AQ -C18 náplň 4 x 3,0 mm (Phenomenex AJ0-7511) HPLC softvér: odel D-7000 Chromatography Data Station Software HPLC systémový anager (erck) Filtračný systém: Vákuové filtračné zariadenie (ilipore) Filtrát acetátu celulózy Veľkosť pórov 0,2 μm ( Sartorius AG 11107-47-N) Ostatné prístroje: ph-eter (ettler Delta 345) Vortex ischer aage (ettler Toledo Ag 241) ultrazvukový kúpeľ 2.1.2 Séra, plazmy, roztoky a moč Séra a plazmy: Na vývoj a validáciu metód boli Zvyšky séra a plazmy, moču a výluhov z rutinnej analýzy centrálneho laboratória v USA univerzitná nemocnica 27