Hyperhomocysteinémia a reprodukčná patológia Repromed

hyperhomocysteinémia a reprodukčná patológia

reprodukčná

Veaceslav Moşin, Alina Hotineanu, Adrian Creţu, Vitalie Scurtu, Iuliana Holban

Článok uverejnený vo Vestníku perinatológie od rep. Moldavsko, v roku 2014, č. 1 (61)

Hyperhomocysteinémia definuje stav, v ktorom koncentrácie nebielkovinovej aminokyseliny - homocysteínu - prekračujú bežné hranice. Hlavným prínosom sú mutácie v génoch cyklu kyseliny listovej (MTHFR, MTR, MTRR), najmä spolu s diétou bez obsahu vitamínov, najmä z komplexu B. V súčasnosti je hyperhomocysteinémia rizikovým faktorom pre tehotenské komplikácie, ako napr.: ruptúra ​​placenty, preeklampsia, poruchy neurálnej trubice, vnútromaternicové obmedzenia rastu, spontánne potraty. V súvislosti s tým je homocysteín toxický pre krvné cievy a môže vyvolať kaskádu vaskulárnych komplikácií vrátane tvorby trombov. Genetické testovanie pacientov umožní odhadnúť riziko hyperhomocysteinémie a trombózy s indikáciou vhodnej liečby a sledovania gravidity.

hyperhomocysteinémia

Homocysteín (Hcy) je neproteínová aminokyselina obsahujúca síru, ktorá nie je prítomná v prírodnej strave, a je metabolickým medziproduktom pri transmetylačných a transsulfurizačných reakciách - dôležité reakcie pri normálnom raste, funkcii a diferenciácii buniek [8]. V krvnej plazme sa Hcy nachádza v rôznych formách: 70% celkového homocysteínu (tHcy) cirkuluje vo forme viazanej na bielkoviny prostredníctvom disulfidových interakcií (hlavne albumínu) [19]; asi 25% sa nachádza vo forme dimérov homocysteínu a zvyšok (5%) sa týka iných tiolov, vrátane cysteínu, redukovaného Hcy a oxidovaných [22].

Plazmatické hladiny Hcy stúpajú s vekom v dôsledku metabolického poklesu Hcy v obličkách. Ženy majú nižšie hladiny Hcy ako muži, čiastočne kvôli vplyvu pohlavných hormónov (estrogén a progesterón) a menštruácie [20].

Za optimálnych fyziologických podmienok je množstvo Hcy na bunkovej úrovni regulované dvoma alternatívnymi metabolickými cestami: ireverzibilnou degradáciou transsulfurizáciou alebo remetyláciou s tvorbou metionínu [3]. Transsulfurizácia, ktorá sa vyskytuje hlavne v pečeni a obličkách, spočíva v kondenzácii Hcy so serínom, ktorá vedie k cystathionínu za účasti enzýmu cystationin-p-syntázy a vitamínu B6 ako kofaktora. V ďalšom kroku cystationín-y-lyáza degraduje cystationín na cysteín a a-ketobutyrát. Cysteín sa oxiduje na atóm síry za vzniku anorganického síranu vylučovaného močom [3]. Na druhej strane, cysteín je prekurzorom glutatiónu - antioxidantu nevyhnutného pri detoxikácii xenobiotík.

Alternatívne je Hcy remetylovaný na metionín pomocou metyl-5-metyltetrahydrofolátu (5-metylTHF) alebo donoru betaínu [16]. Týmto spôsobom je metabolizmus Hcy úzko spojený s folátovým cyklom: enzýmom metionín syntáza (MTR) katalyzuje prenos metylovej skupiny z 5-metylTHF na Hcy tvorbou metionínu a THF (tetrahydrofolátu), pričom k tejto reakcii dochádza vo všetkých bunkách okrem erytrocytov. MTR vyžaduje kofaktor kobalamín (Cbl) a komplex tvorený Cbl (I) MTR viaže metylovú skupinu, čo vedie k metylCbl (III) MTR. Po prenose sa Cbl (I) MTR reformuje a môže prijať ďalšiu metylovú skupinu. Kobalamín sa súčasne mierne oxiduje na formu Cbl (II) a komplex Cbl (II) MTR sa stáva neaktívnym. Ďalší enzým - metionín syntáza reduktáza (MTRR) - má funkciu reaktivácie komplexu Cbl (II) MTR redukčnou metyláciou [14].

Následne je konverzia THF na 5,10-metylén THF katalyzovaná enzýmom MTHFD1 a je na enzýme, aby obnovil metylovú skupinu na Hcy remetyláciu MTHFR ktorý redukuje 5,10-metylénTHF na 5-metylTHF, kofaktorom je vitamín B2 (riboflavín).

Obrázok 1. Metabolizmus homocysteínu: cesta remetylácie metionínu a cesta transsulfurizácie s tvorbou produktov, ako sú cysteín a síran

Hyperhomocysteinémia (HHcy)

HHcy je dôsledkom nedostatku enzýmov a/alebo výživových nedostatkov vitamínov, ktoré narúšajú normálny metabolizmus metionínu a/alebo Hcy. Zvýšená extracelulárna koncentrácia Hcy je toxická pre bunky a tkanivá a môže iniciovať kaskádu vaskulárnych komplikácií [25]. Normálne limity Hcy sú medzi 5 a 15 μM [11]. Vyššie hodnoty sú spojené s formami: stredná (15 - 30 μM), stredná (30 - 100 μM) a závažná (> 100 μM) HHcy [12]. Existuje komplexná interakcia medzi genetickými, metabolickými a environmentálnymi faktormi, ktorá udržuje hladinu homocysteínu v normálnych medziach. Zmeny faktora alebo kombinácie faktorov môžu zvýšiť hladinu tHcy (celkový homocysteín). Podľa Steeed [25] boli študované 4 podmienky, ktoré vysvetľujú vývoj HHcy: 1) strava bohatá na metionín; 2) nedostatok vitamínov (B12, B6 a kyselina listová);
3) renálna dysfunkcia; 4) genetické abnormality (v génoch MTHFR, MTR, MTRR, CBS).

Obrázok 2. Faktory hyperhomocysteinémie (HHcy): 4 cesty akumulácie homocysteínu

Poďme ich preskúmať podrobnejšie:

1) Polovica množstva metionínu prijatého príjmom potravy sa prevedie na Hcy [7]. Štúdie na zvieratách naznačujú, že strava bohatá na metionín v prítomnosti vitamínov B6, B12 a nedostatku kyseliny listovej môže zvýšiť riziko aterosklerózy a srdcových vaskulárnych chorôb, zatiaľ čo strava bohatá na rastlinné potraviny a ovocie udržuje hladinu Hcy v normálnych medziach [1].

2) Kofaktory odvodené z vitamínov B-komplexu (B2, B6, B9, B12) sa zúčastňujú enzymatických reakcií, ktoré regulujú metabolizmus Hcy. Niekoľko štúdií ukazuje, že jedinci s hyperhomocysteinémiou majú neadekvátne koncentrácie jedného alebo viacerých enzýmových kofaktorov [23]. A koncentrácia Hcy je nepriamo úmerná plazmatickej koncentrácii folátu, vitamínu B12 a B6 [10]. Kyselina listová (rozpustná forma vitamínu B9) je potrebná pri delení a diferenciácii buniek, najmä počas tehotenstva. Deriváty kyseliny listovej sú donormi monokarbónových jednotiek na syntézu purínových a pyrimidínových zložiek DNA a RNA a klonovaním kovovej skupiny - podieľajú sa na epigenetickej regulácii.

3) Obličky sú hlavným miestom metabolizmu Hcy s 3 enzýmami: MTR, CBS a cystationin-y-lyázou [9]. Renálna dysfunkcia je sprevádzaná zvýšením hladiny tHcy a štúdie Arnadottiru ukazujú nepriamo úmerný vzťah medzi nameranou rýchlosťou glomerulárnej filtrácie a hladinou tHcy.

4) Genetické abnormality v enzýmoch metabolizmu Hcy môžu zvýšiť koncentráciu tHcy a závažnosť zmien závisí od miesta génovej mutácie [25]. Najprijateľnejším polymorfizmom spojeným s variabilitou Hcy je 677C> T v géne MTHFR, ktorý v enzýmovom zložení nahrádza Ala vo Val. Kang a kol. identifikovali variant enzýmu MTHFR charakterizovaný nízkou aktivitou a „termolabilitou“ [13]. Enzymatická aktivita v prípade heterozygotných CT a homozygotných TT genotypov je znížená o 35%, respektíve 70% [25] a termolabilná forma je genetickým markerom strednej HHc a u osôb s 677TT genotypom (3). Táto asociácia sa súčasne pozoruje iba súbežne s neadekvátnymi koncentráciami folátu. Guenthlerove (1999) štúdie preukázali na modeli E. coli, že oslabenie väzby FAD je zodpovedné za zníženie enzymatickej aktivity a ochrannú úlohu pred stratou FAD hrá dokonca aj fólia [6].

Polymorfizmus 1298A> C génu MTHFR spočíva vo výmene Glu s Ala. Je relevantné, že ani homozygotný, ani heterozygotný stav polymorfizmu nemení hladinu Hcy v plazme [15]. Avšak stav heterozygotnej zlúčeniny pre C677T a A1298C je spojený so zníženou enzymatickou aktivitou, vysokými hladinami Hcy a nízkymi koncentráciami folátu v plazme [5].

V polymorfizme 66A> G génu MTRR je izoleucín substituovaný metionínom. Niektoré štúdie uvádzajú tento polymorfizmus ako rizikový faktor pre DTN (defekty neurálnej trubice) [21].

Homocysteín a kardiovaskulárne choroby

Prvý dôkaz možných negatívnych účinkov Hcy na cievnu stenu uviedol McCully v roku 1969 [18]. Podobné vaskulárne lézie sa našli u 2 pacientov so závažnou HHcy v dôsledku vrodených chýb metabolizmu Hcy a podľa „teórie homocysteínu“ sa predpokladá, že Hcy a jeho deriváty sú toxické pre krvné cievy. Na druhej strane výsledky metaanalýz pokrývajúcich 24 100 subjektov ukazujú, že normalizačná terapia homocysteínom neznižuje riziko infarktu myokardu a mozgu, čo sa vysvetľuje skutočnosťou, že tieto testy boli založené na predpise kyseliny listovej [17]. Suplementácia folátovou terapiou je na jednej strane prospešná, ale antagonistickým účinkom je urýchlenie proliferácie a zápalu - základných procesov pri tvorbe aterosklerotického plaku, hlavne kvôli úlohe metabolizmu folátu pri poskytovaní monokarbónových jednotiek pre syntézu purínov a pyrimidínov v štruktúre DNA. RNA [4].

Posledné štúdie popisujú 3 patologické mechanizmy, ktoré sú podkladom vaskulárnych komplikácií spôsobených Hcy: oxidačný stres, endotelová dysfunkcia a vaskulárna remodelácia - integrované do „Toxickej triády“ [4].

Obrázok 3. Toxická triáda: Patologické mechanizmy, ktoré sú základom vaskulárneho ochorenia spôsobeného homocysteínom.

Výskum naznačuje, že Hcy primárne napáda vaskulárny endotel a iniciuje kaskádu vaskulárnych komplikácií. Klinické pozorovania a štúdie na zvieratách identifikovali možné ciele Hcy: EC (endotelové bunky), VSMC (svalové bunky), spojivové tkanivá, krvné doštičky, koagulačné faktory, lipidy, signálne transdukčné molekuly NO (oxid dusnatý) [25 ]. Neexistuje však jednotná hypotéza, ktorá by vysvetľovala, ako Hcy spôsobuje poškodenie ciev. Molekulárne a bunkové účinky HHcy sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1. Mechanizmy hyperhomocysteinémie

Molekulárne účinky HHcy Bunkové účinky HHcy
Zníženie produkcie NO (oxidu dusnatého) Endoteliálna dysfunkcia
Zníženie množstva dostupného NO Narušená vazorelaxácia endotelových buniek
Oxidačný stres Mitochondriálne poškodenie
Peroxidácia lipidov Proliferácia buniek hladkého svalstva
zápal Degradácia extracelulárnej matrix
zrážanlivosť Poškodenie DNA a RNA
Tvorba trombov APOPTÓZA

Materiály a metódy: Výskumnú skupinu tvorili pacienti z Medical Center s reprodukčnými problémami vrátane spontánnych a opakovaných potratov. Genomická DNA bola extrahovaná po špecializovaných súpravách (GeneJet Celokrvná génová DNA purifikovaná mini súprava, Fermentas) z leukocytov periférnej krvi. Krvné vzorky sa odoberali do jednorazových skúmaviek EDTA venepunkciou.

Na genetické testovanie polymorfizmov MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTR A2756G a MTRR A66G sa uskutočňovali reakcie PCR/RFLP (reťazová polymerizačná reakcia a polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov) so špecifickými primermi prevzatými z článkov v literatúre. 27,24]. Genomická DNA sa amplifikovala pomocou polymerázy Dream Taq („Fermentas“, USA) v termocykle „TProfessional Basic 96“ (Biometra, Nemecko). Reakčné podmienky sú podobné pre všetky polymorfizmy okrem teploty nastavenia priméru: 60,4 ° C pre MTHFR C677T, 61 ° C pre MTHFR A1298C, 58,4 ° C - MTR A2756G, 57,6 ° C - MTRR A66G a štandardné podmienky protokolu sú: denaturácia počiatočná pri 95 ° C - 3 minúty, 33 cyklov: 94 ° C - 30 sekúnd, 57,6 - 61 ° C - 30 sekúnd, 72 ° C - 30 sekúnd a konečné predĺženie pri 72 ° C - 5 minút.

Amplikóny boli reštrikované 3 hodiny pri 37 ° C reštrikčnými enzýmami špecifickými pre každý polymorfizmus: Hinf I pre MTHFR C677T, Mbo II pre MTHFR A1298C, Hae III - MTR A2756G a Nde I - MTRR A66G.

Overenie reštrikčných produktov sa uskutočnilo pomocou gélovej elektroforézy PAAG (polyakrylamid) s koncentráciou 7,5% - za podmienok: 200 V počas 3 hodín. Gél sa zafarbil roztokom etídiumbromidu. A výsledky boli sledované v systéme UV SOLO (Nemecko). Veľkosti fragmentov sú znázornené na obrázku 4.

Obrázok 4. Elektroforogram PCR/RFLP analýzy polymorfizmov génu folátového cyklu:

  1. A) MTHFR C677T: Značka M - 50 bp; 1 - amplikón (227 bp); 4 - 8 - normálny homozygot (205 bp); 2 - heterozygot (205, 129, 76 bp); 3 - homozygot po mutácii (129, 76 bp);
  2. B) MTHFR A1298C: Značka M - 50 bp; 1 - amplikón (163 bp); 4 - normálny homozygot (56, 31, 30, 18 bp); 3, 5, 7 - heterozygot (84, 56, 31, 30, 18 bp); 2 - homozygot po mutácii (84, 31, 30, 18 bp);
  3. C) MTR A2756G: 2, 3, 5, 6, 9 - normálny homozygot (421, 81 bp); 1, 4, 7, 8 - heterozygot (421, 269, 152, 81 bp); 10 - homozygot po mutácii (269, 152, 81 bp);
  4. D) MTRR A66G: Značka M - 50 bp; 2-amplikón (145 bp); 5, 6 - normálny homozygot (145 bp); 4 - heterozygot (145, 123, 22 bp); 3 - homozygot po mutácii (123, 22 bp).

Výsledky a diskusie: Výsledky genotypizácie sú uvedené v diagramoch 1 - 4. Na vyhodnotenie vierohodnosti získaných výsledkov boli použité všeobecne akceptované vzorce z variačnej štatistiky pomocou programu SISA. V tejto súvislosti boli frekvencie alel a genotypových tried vypočítané podľa Hardyho-Weinbergovho vzorca a na porovnanie frekvencií genotypov bolo použité Pirsonovo kritérium - X 2 .

Diagram 1. Distribúcia frekvencie genotypových tried polymorfizmom MTHFR C677T

Diagram 2. Frekvenčné rozdelenie genotypových tried polymorfizmom MTHFR A1298C

Diagram 3. Frekvenčné rozdelenie genotypových tried podľa polymorfizmu MTRR A66G

Diagram 4. Frekvenčné rozdelenie genotypových tried polymorfizmom MTR A2756G

Pri porovnaní rozdelenia frekvencií pozorovaných genotypov a tých, ktoré sa teoreticky očakávajú pri teste X 2, nebola pre študovaný polymorfizmus objasnená štatisticky významná odchýlka od Hardy-Weinbergovej rovnováhy: MTHFR C677T (X 2 = 0,575; p> 0,05); MTHFR A1298C (X2 = 3,766; p = 0,052); MTR A2756G (X2 = 2,332; p> 0,05); MTRR A66G (X2 = 2230; p> 0,05);

1) Homocysteín vo veľkom množstve má toxický účinok na endotel krvných ciev stimulujúci tvorbu trombov.

2) Hyperhomocysteinémia je rizikovým faktorom pre komplikácie tehotenstva v rôznych dobách, vrátane preeklampsie, prerušenia placenty, vnútromaternicových obmedzení rastu a spontánnych potratov.

3) Genetické testovanie po mutáciách v génoch metabolizmu homocysteínu a kyseliny listovej umožňuje odhadnúť riziko a predpísať vhodnú liečbu.