Indukcia akcelerovanej aterosklerózy u myší Protokol modelu poranenia drôtom (preložené do
Zhrnutie
Táto štúdia popisuje invazívnu metódu indukcie akcelerovanej aterosklerózy u myší. V porovnaní s inými metódami, ktoré používajú elektrické alebo kryoindukované poranenia, mechanicky indukované poranenie napodobňuje ľudský stav restenózy po revaskularizačných terapiách a je ideálny na štúdium zapojených molekulárnych mechanizmov.
Abstrakt
Ateroskleróza je proliferatívne fibro-zápalové ochorenie, ktoré sa vyvíja v arteriálnej stene a vyvoláva nedostatočný prietok krvi alebo nedostatok prietoku krvi. Okrem toho artérioskleróza indukuje okluzívnu tvorbu trombov prasknutím poškodenej steny cievy, čo je hlavná príčina infarktu myokardu alebo mozgovej príhody a najbežnejšia príčina smrti. Napriek pokroku v kardiovaskulárnej oblasti zostáva veľa otázok nezodpovedaných a je potrebný ďalší základný výskum, ktorý by zlepšil naše chápanie molekulárnych mechanizmov podieľajúcich sa na ateroskleróze a jej dôsledkoch. Kvôli obmedzeným klinickým štúdiám sú potrebné reprezentatívne zvieracie modely, ktoré simulujú aterosklerotické ochorenia, ako je tvorba neointimy po implantácii stentu, balóniková angioplastika alebo endarterektómia. Pretože myš ponúka mnoho výhod a je najbežnejšie používaným modelom na štúdium molekulárnych procesov, súčasná štúdia navrhuje invazívnu metódu denoteácie endotelu, ktorá je známa aj ako model poranenia drôtom a ktorá predstavuje ľudský stav tvorby neointimy v tepnách po revaskularizácii. je.
Úvod
Hlavnou nevýhodou myšieho modelu je malá veľkosť hlavných tepien vystavených aterosklerotickému ochoreniu (krčná tepna, aorta a femorálna artéria), ktoré si vyžadujú kvalifikované chirurgické znalosti a zručnosti na manipuláciu s cievami a invazívnu indukciu aterosklerotického plaku. Preto je model urýchlenej tvorby neointimy navrhnutý v tomto dokumente v kontexte restenózy po endarterektómii alebo zavedení stentu predstavený podrobným pokynom a návrhmi na uľahčenie zavedenia pre zainteresovaný personál. Ďalšou nevýhodou je, že na normálnej arteriálnej stene dochádza k denudácii, a preto bude tvorba neointimy v porovnaní s klinickou situáciou mierna. Vysoké hladiny plazmatického cholesterolu dosiahnuté u myší s vylučovaním apolipoproteínu E (Apoe -/-) kŕmených stravou s vysokým obsahom tukov vytvárajú správne prozápalové prostredie potrebné na tvorbu neointimy.
Operácia sa vykonáva pod stereomikroskopom. Karotída je odkrytá stredným rezom v prednej cervikálnej oblasti. Anatomické štruktúry na krčnej tepne a okolo nej sú minimálne manipulované, aby sa znížil pooperačný zápal. Bifurkácia krčnej tepny je pozastavená. Na vyvolanie zrýchlenej tvorby neointimy sú pripravené vnútorné a vonkajšie krčné tepny na zachytenie toku a následné časté odmietnutie krčnej tepny. Stručne povedané, metódu sa môžu naučiť pracovníci s minimálnymi skúsenosťami s chirurgickým zákrokom na zvieratách.
Protokol
Pokusy uvedené v tomto dokumente sa uskutočňujú podľa nemeckých právnych predpisov a európskych smerníc o starostlivosti o zvieratá. Zvieratá sa chovajú v zariadení pre zvieratá Ústavu pre vedu o laboratórnych zvieratách na univerzitnej klinike v Aachene pod vedením prof. Dr. R. Tolba a Dr. A. Teubner (referent pre dobré životné podmienky zvierat) chovaný.
- Uchovávajte myši v špecializovanej pestúnskej jednotke, aby sa zabezpečil adekvátny prístup k potrave a špecializovaná veterinárna kontrola a ošetrenie. Ak sú zvieratá premiestňované alebo kupované treťou stranou, pred zákrokom si zabezpečte týždenné ustajnenie.
- 6 - 8 týždňov staré, krmivo 18 - 20 g, samice (voliteľné) ApoE -/- myši s aterogénnou stravou (21% tuku, 0,15% cholesterolu, 19,5% kazeínu, W/Wt) týždeň predtým chirurgicky a pokračujte v diéte, kým sa neurobí analýza aterosklerotických plakov.
3. Chirurgická príprava
- Vyberte navíjače a vráťte svalovú vrstvu a dve tukové telá do fyziologickej polohy.
- Ak sú potrebné echokardiografické merania, uzavrite pokožku tromi samostatnými stehmi 0/6. Ak snímanie nie je potrebné, na uzavretie pokožky použite kovové spony.
- Umiestnite myš pod infračervené svetlo na ľavej strane, kým sa neprebudí. Nenechávajte zviera bez dozoru alebo s inými zvieratami, kým sa úplne nezotaví.
- Zvýraznite myš pre budúcu identifikáciu s miestnym systémom. Opýtajte sa referenta pre dobré životné podmienky zvierat v miestnom zariadení.
6. Analýza aterosklerotického plaku
Reprezentatívne výsledky
Procedúra indukcie aterosklerotického plaku trvá 15-20 minút a vykazuje minimálnu mieru úmrtnosti, hlavne v dôsledku krvácania, ku ktorému dôjde počas postupu. Po operácii sa myši zotavili z anestézie do 20 až 25 minút. Po operácii neboli pozorované žiadne fyzické poškodenia, ako napríklad ochrnutie alebo poruchy príjmu potravy.
Poranenie drôtu indukuje deendotelizáciu, ktorá napodobňuje vaskulárne lézie po vondulácii balónom alebo implantácii stentu. Okamžite po poranení bude obnažená vaskulárna stena pokrytá vrstvou krvných doštičiek, ktorá sprostredkováva a podporuje adhéziu monocytov 12. Aktivované bunky hladkého svalstva z médií sa množia a migrujú do intímnych priestorov, ktoré tvoria neointimu. Ďalšie prekurzory buniek hladkého svalstva migrujú z krvi (odhadom 40%) a prispievajú k neointimálnemu rastu. Tvorba plakov sa zastaví po úplnej re-endotelizácii, zvyčajne 4 týždne po poranení drôtu.
Tvorbu neointimy je možné hodnotiť pomocou Movatovho farbenia. Veľkosť plaku sa pre každý film počíta pomocou softvéru, ako je uvedené v Obrázok 2Bzobrazené. Celková veľkosť plaku (ľavá krčná tepna) sa môže pohybovať medzi 70 000 a 100 000 m2, zatiaľ čo veľkosť kontrolnej cievy (pravá krčná tepna) sa môže pohybovať medzi 7 000 a 8 000 m2. Tieto hodnoty vo veľkej miere závisia od chirurga. Preto dôrazne odporúčame počas experimentov používať pre rovnakú štúdiu rovnakého chirurga.
Vyvinutý plak pripomína restenózu stentu, ktorá pozostáva prevažne z replikovaných a migrovaných buniek hladkého svalstva z média. v stente Bunkové zloženie stanovené imunologickým farbením ukazuje, že obsah buniek hladkého svalstva je okolo 30 - 40%, zatiaľ čo makrofágy sa nachádzajú v 15 - 25% neointimy poranenej cievy. Reendotelizáciu je možné merať po zafarbení endoteliálneho markera a vypočítať ako percento obvodu, ktorý je zafarbený po celom obvode lúmenu. Spravidla dosahuje re-endotelizácia po 3 týždňoch 80 - 90% a po 4 týždňoch by mala byť takmer úplná (Obrázok 2C). Ak chcete sledovať rast plakov, ako sa vyvíjajú, je možné opakovať rovnakú analýzu pre každý okamih po poranení drôtom, v závislosti od záujmu a študovanej témy (pozri stôl 1).
Diskusia
V tomto príspevku poskytujeme užitočné tipy na vykonanie zákroku poranenia drôtom aj u zamestnancov s minimálnymi skúsenosťami s chirurgickým zákrokom na zvieratách. Pri vykonávaní tohto postupu existujú dva kritické kroky: prerezanie vonkajšej krčnej tepny a zavedenie drôtu. Rez na vonkajšej krčnej tepne musí byť urobený čo najďalej od rozdvojenia, aby sa zabezpečil dostatok zvyškového materiálu (Obrázok 1C). Rez by nemal byť príliš veľký, pretože existuje riziko porezania celej cievy. Druhým kritickým krokom je vysoké riziko krvácania počas artériotomie a zavedenia vodiaceho drôtu, ak nie je efektívne kontrolovaný prietok krvi. Okrem toho, ak vodiaci drôt nie je správne vložený do lúmenovej cievy, nemôže dôjsť k denudácii endotelu alebo prasknutiu tepny. Aby sa tomu zabránilo, musí byť povrch vodiaceho drôtu pred použitím starostlivo vyleštený.
S cieľom optimalizovať protokol zaisťuje poloha operačného stola s hlavou myši v smere chirurga lepšiu viditeľnosť, prístupnosť a kontrolu pre správnu manipuláciu s navádzacím drôtom. Na zvýšenie reprodukovateľnosti používajte vo všetkých štúdiách rovnaký vodiaci drôt. Pretože sa veľkosť drôtu nemení, je dôležité zohľadniť a vylúčiť všetky možné rozdiely medzi myšami pomocou rovnakého pohlavia, veku a hmotnosti pre všetky myši zahrnuté do štúdie. Potom farbenie Evansovou modrou pomôže chirurgovi určiť účinnosť denudácie. Dostupnosť vhodného vybavenia je predpokladom úspechu postupu. Na vykonanie tohto postupu je nevyhnutný 10-násobný stereoskopický mikroskop. Správna príprava navádzacieho drôtu (napr. Leštenie) je rozhodujúca. Dôrazne preto odporúčame, aby prípravu drôtu vykonal špecializovaný technický personál, ak je k dispozícii.
Tento protokol obsahuje mnoho krokov na riešenie problémov. Ak rezáte vonkajšiu krčnú tepnu v blízkosti rozdvojenia, opatrne zviažte vonkajšiu stranu v blízkosti rozdvojenia, aby nedošlo k krvácaniu. Pri rezaní nie je vidieť vonkajšiu krčnú tepnu. Zvážte preto rozdvojenie na úrovni hodvábneho stehu. Keď hodvábny šev zmizne, zhromaždite časti. Ak je rez na vonkajšej krčnej tepne príliš veľký a cieva je zlomená, uistite sa, že je efektívne odrezaný prietok krvi do krčnej tepny a vnútornej krčnej tepny, a pokúste sa nájsť otvor cievy pomocou klieští. Po zavedení a denudácii vodiaceho drôtu priviažte nádobu v blízkosti rozdvojenia. Počas strihania sa začnite zhromažďovať, keď začne hodváb miznúť zo švu. Ak počas denudácie vodiacim drôtom dôjde k prasknutiu tepny, skontrolujte pod mikroskopom, či je vodiaci drôt správne vyleštený.
Napriek podobnosti modelu poranenia drôtom s klinickými situáciami sa veľa skupín zameriava na pôvodnú aterosklerózu u myší alebo si zvolí indukciu invazívnej aterosklerózy, ako je balónová angioplastika u potkanov alebo králikov, kvôli nedostatku vyškoleného personálu schopného vykonávať operácie na zvieratách v malom rozsahu. Napriek výhodám používania králikov/potkanov napr. Napríklad bez miniaturizovaného vybavenia neponúkajú modely potkanov ani králikov širokú škálu rôznych vyraďovacích kmeňov na štúdium molekulárnych mechanizmov podieľajúcich sa na neointimálnom raste a trombóze v stente.
Denudácia sa vykonáva na normálnej arteriálnej stene, aj keď s aterosklerotickým pozadím. Preto bude tvorba neointimy v porovnaní s klinickou situáciou mierna. Vysoký počet predklinických modelov ukazuje, že žiadny z modelov nespĺňa všetky kritériá potrebné na odhalenie všetkých bunkových a molekulárnych mechanizmov, ktoré vedú k patofyziológii u ľudí (pozri Tabuľka 2).
Po dokončení postupu poranenia drôtom je možné vykonať ďalšie biologické a molekulárne analýzy na identifikáciu buniek, proteínov, mRNA, mikroRNA, génov alebo iných biomarkerov, ktoré sa môžu použiť ako terapeutické ciele na vývoj nových liečebných stratégií pre aterosklerózu, najmä pre tvorbu neointimy po cievnom poranení. . Ak je k dispozícii, je možné rast plakov monitorovať vysokofrekvenčným ultrazvukom alebo inými zobrazovacími technikami s vysokým rozlíšením. Osvojenie tejto techniky by navyše operátorovi umožnilo prispôsobiť protokol iným modelom indukcie invazívnej aterosklerózy, ako sú: B. Umiestnenie obojku, čiastočná ligácia alebo dokonca implantácia stentu.