Izolácia RNA - biológia
Aké horúce je príliš horúce na život hlboko pod dnom oceánu?
Antibiotiká z baktérií
Migrácia buniek: novoobjavená funkcia známeho proteínu
Molekulárny kompas na zarovnanie buniek
Čo robí listy na jeseň starnúcimi
Demokracia perličiek
Prostredie spoločnosti Ekembo: Ľudia tiež žili v otvorenej krajine
| Genetika | Poľnohospodárstvo, lesníctvo a chov zvierat
Pšeničná odroda vznikla krížením divých tráv
Aké horúce je príliš horúce na život hlboko pod dnom oceánu?
Izolácia RNA
The Izolácia RNA z buniek umožňuje analýzu aktuálnej bunkovej aktivity v určitom časovom okamihu, pretože ako gény sú v okamihu izolácie dostupné iba gény, ktoré sú v súčasnosti v bunke transkribované. Izolácia RNA je teda dôležitou technikou v molekulárnej biológii a izolovaná RNA sa môže použiť v mnohých metódach na analýzu génovej expresie.
Špeciálne vlastnosti pri manipulácii s RNA
RNázy (enzýmy, ktoré katalyzujú štiepenie RNA na menšie fragmenty) sú mimoriadne stabilné a môžu byť aktívne aj po autoklávovaní. RNA je veľmi citlivá na degradáciu RNázami, ktorých prirodzenou úlohou je hydrolýza fosfodiesterových väzieb vo fosfátovom reťazci RNA nezávislá od Mg2+. Zaobchádzanie s RNA si preto vyžaduje väčšiu starostlivosť ako práca s oveľa stabilnejšou DNA. Aby sa zabránilo degradácii RNA, mali by sa RNA a RNázy v počiatočnom štádiu od seba oddeliť a malo by sa zabrániť zavedeniu RNáz z prostredia do vzorky. Mali by sa preto používať jednorazové rukavice, pretože RNázy produkujú všetky organizmy, a preto sú prítomné aj na povrchu kože v ľudskom pote. Ďalej má zmysel používať určitú sadu spotrebného materiálu (pipety, škatule s pipetami atď.) Iba na experimenty s RNA. Okrem toho by sa mala použiť špeciálna voda neobsahujúca RNázu.
Izolácia RNA
Ako už bolo uvedené, pri izolácii RNA je veľmi dôležité čo najskôr oddeliť RNázy od RNA. Všetky spôsoby izolácie RNA sú založené na lýze buniek v chemickom prostredí, v ktorom sú RNázy rýchlo denaturované. RNA sa potom oddelí od ostatných bunkových zložiek. Týmto spôsobom sa získa celková RNA. Táto celková RNA sa môže použiť priamo na ďalšie experimenty (napr. Northern blot, reverzná transkripcia v cDNA), alebo sa môže použiť ako východisková látka na izoláciu mRNA.
Chomczynského a Sacchiho metóda
Pri tejto metóde sa používa špeciálne činidlo (napr. TRIzol Reagent® od spoločnosti Invitrogen alebo TriFast ™ od spoločnosti peqLab). To umožňuje získať RNA z buniek alebo tkanív podľa konkrétneho protokolu. Tento postup je založený na tzv „Jeden krok“ Chomczynského a Sacchiho metóda. Trizol obsahuje guanidíniumtiokyanát, ktorý rozkladá bunky a súčasne deaktivuje RNázy a ďalšie enzýmy. Činidlo tiež obsahuje fenol, v ktorom sa rozpúšťajú DNA a bielkoviny. Fázy sa oddelia pridaním chloroformu a potom centrifugáciou. Potom možno rozpoznať tri fázy. Horná vodná fáza obsahuje RNA, medzifázovú DNA a proteíny dolnej chloroformovej fázy. RNA vo vodnej fáze sa potom vyzráža izopropanolom alebo etanolom. Po dvoch krokoch premývania sa RNA rozpustí napríklad vo vode neobsahujúcej RNázu a je k dispozícii pre ďalšie použitie.
Metóda „Nonidet P-40“
Táto metóda nie je vhodná pre tkanivo a používa sa na získanie mRNA z cytosolu. Výhodou tejto metódy je, že bunkové jadrá zostávajú neporušené, a teda existuje aj možnosť izolácie DNA. Princíp je založený na neiónovom detergente Nonidet P-40, ktorý sa pridáva do buniek a DNA (bunkové jadrá) sa po centrifugácii usadzuje ako peleta. RNA, proteíny a bunkové zvyšky zostávajú v roztoku. Potom nasleduje ako s „Jeden krok“ Izolácia metódy zmesou fenol/chloroform.
Systémy súprav
Ako ďalšia možnosť izolácie RNA je k dispozícii mnoho systémov súprav od rôznych spoločností a v mnohých prevedeniach (napr. RNeasy Mini Kit® od spoločnosti Qiagen). Tieto systémy súpravy používajú malé stĺpce, ktoré špecificky viažu RNA.
Stanovenie koncentrácie pomocou spektrofotometrie
Pri určovaní koncentrácie spektrofotometriou sa meria optická hustota pri λ = 260 nm (OD260), absorpčnom maxime nukleových kyselín (DNA, RNA) a pri λ = 280 nm (OD280), absorpčnom maxime proteínov. To, či je vzorka kontaminovaná genómovou DNA alebo proteínmi, sa dá určiť z kvocientu OD260 a OD280. Pre čistú RNA by mal byť pomer okolo 2,0. Ak je hodnota nižšia ako táto, je vzorka kontaminovaná bielkovinami, genómovou DNA a/alebo aromatickými látkami. V takom prípade by mala byť RNA znovu purifikovaná. Pretože OD260 1 zodpovedá 40 ug/ml RNA, je možné koncentráciu RNA vypočítať pomocou nasledujúceho vzorca:
Koncentrácia [ug/ml] = OD260 × 40 µg/ml × riediaci faktor