Kvasinky - biológia

Kvasinky sú jednobunkové huby, ktoré sa množia klíčením alebo delením (štiepením). Väčšina patrí do oddelenia Ascomycota, ale vývojové štádiá iných húb sa označujú aj ako kvasinky. Príklady hubových kvasiniek (Basidiomycota) sú štádiá výhonkov rôznych nahých druhov Basidia (Exobasidium), určité vývojové štádiá mnohých plesňových húb alebo dokonca prípadne ľudských patogénnych húb, ako sú Malassezia furfur.

Dejiny a význam

Kvasinky sú jedným z najdôležitejších komerčných mikroorganizmov, ktoré ľudstvu vždy slúžili. Už v raných rozvinutých civilizáciách na Blízkom východe sa alkoholické nápoje, víno a pivo, ako aj chlieb vyrábali pomocou kvasníc, bez znalosti kontextu. Zákon o bavorskej čistote z roku 1516 nezmieňuje ani kvasinky.

Až Louis Pasteur (1822–1895) opísal vo svojej práci Études sur la bière, že kvasinky pozostávajú z mikroorganizmov a že prítomnosť týchto organizmov je pre fermentačný proces nevyhnutná. Pasteur dokázal, že bez kvasníc nedochádza k fermentácii a prítomnosť iných organizmov (divoké kvasinky alebo baktérie) narušila fermentačné správanie, čo viedlo k znehodnoteniu pív alebo vín. Kvasinky sa používajú na výrobu piva, vína, liehovín, potravín a najrôznejších biochemických a terapeutických látok. Niektoré kvasinky spôsobujú kazenie potravín a krmív, iné majú lekársky význam.

Kvasinky hrajú dôležitú úlohu ako modelové organizmy v biológii, pretože sa dajú ľahko kultivovať, geneticky modifikovať a skúmať v laboratóriu. Patria medzi najmenšie eukaryotické organizmy. Pretože sú to eukaryoty, ich podobnosť s vyššími organizmami je podstatne vyššia ako s baktériami.

biológia

Kvasinky sa množia nepohlavne klíčením alebo delením. Taktiež dochádza k pohlavnému rozmnožovaniu, u Ascosporidae s tvorbou asku a askospór, u Basidiosporidae s tvorbou bazidiospór.

Ako eukaryoty sú kvasinky všeobecne oveľa väčšie ako väčšina baktérií a majú typické bunkové štruktúry eukaryotov: zložité membránové štruktúry, chromozómy a veľké množstvo organel vrátane mitochondrií a endoplazmatického retikula, štruktúry, ktoré sa v prokaryotoch (baktérie a archaea) nenachádzajú.

Dnes je známych asi 700 druhov kvasiniek s viac ako 5 000 kmeňmi, ale iba niekoľko z nich bolo presne opísaných. V súčasnosti neexistuje nijaká záväzná definícia kvasiniek, pretože vlastnosti niektorých dobre známych kvasiniek, ako napríklad alkoholová fermentácia a reprodukcia prostredníctvom bunkového delenia, nie sú spoločné pre všetky kvasinky a nie sú pre ne jedinečné.

Väčšina kvasiniek je fakultatívne anaeróbnych, to znamená, že nie sú závislé od kyslíka. Ak je kyslík k dispozícii, rovnako ako väčšina iných živých vecí, môžete ho použiť na oxidačný energetický metabolizmus (aeróbne dýchanie): Môžete oxidovať rôzne cukry, aby vytvorili oxid uhličitý a vodu. Pri nedostatku kyslíka však môže veľa kvasiniek rozkladať cukry iba na nízkomolekulárne látky, napríklad na etanol a oxid uhličitý (napríklad pri alkoholovom kvasení). Oxidácia cukru za aeróbnych podmienok poskytuje viac energie ako kvasenie. Preto je rýchlosť hromadného rastu a rýchlosť bunkového delenia omnoho vyššia pri štiepení oxidačného cukru ako pri fermentácii. [1] [2]

Kvasinky používajú širokú škálu sacharidov. Doposiaľ však nebol opísaný žiadny druh, ktorý by dokázal využiť všetky prirodzene sa vyskytujúce cukry. Niekoľko príkladov: Vrchne kvasiace kmene kvasiniek Saccharomyces cerevisiae môže používať glukózu, fruktózu, manózu, galaktózu, sacharózu, maltózu, maltotriózu a rafinózu. Úzko príbuzné druhy Saccharomyces diastaticus a stonky spodného kvasenia Saccharomyces cerevisiae (skôr ako druh S. uvarum alebo S. carlsbergensis rešpektovať) tiež používajte dextríny a melobiózu. Saccharomyces cerevisiae a ich príbuzní však nemôžu používať pentózy, ako je ribóza, xylóza a arabinóza, ani cellobiózu, laktózu, inulín a celulózu.

druhov

Biotechnické využitie

Kvasinky sa používajú v širokej škále biotechnologických procesov. Najznámejšia je výroba nápojov obsahujúcich etanol, ako je pivo alebo víno (a iné alkoholické nápoje), ako aj samotný etanol. Najmä cukrovinky (Saccharomyces) sa používajú na chlieb („biela pekáreň“, kvasnicové cesto) a výrobu piva.

Ak kvapalina, ktorá sa má fermentovať, obsahuje pektín, počas fermentácie sa vyrába metanol, ktorý sa v ľudskom tele rozkladá na metanal (formaldehyd) a následne na kyselinu metánovú (kyselina mravčia) a môže viesť k slepote.

Aj keď je taxonómia (biologická systematická klasifikácia) kvasiniek kontroverzná, najmenej 1 000 samostatných kmeňov Saccharomyces Sú definované. Priemysel sa zameriava viac na vlastnosti jednotlivých kmeňov ako na celkové taxonomické klasifikácie. Pre taxonómiu môžu mať v technickej aplikácii rozhodujúci význam „nepatrné“ rozdiely medzi kmeňmi, ako napríklad vrchná alebo spodná fermentácia, ako aj teplotné optimá. Klasická kultivácia kvasiniek sa javí ako zložitá, pretože väčšina kmeňov používaných priemyselne je polyploidná alebo aneuploidná a v dôsledku toho nemá životný cyklus haploid-diploid. Tieto kmene sú preto geneticky stabilnejšie, ale ťažko ponúkajú vhodné reprodukčné aktivity na použitie klasických metód šľachtenia. Avšak techniky zahrnujúce tvorbu sféroplastik a rekombinantnej DNA vedú k tvorbe ďalších kmeňov kvasiniek s priemyselným potenciálom. Tieto techniky sú veľmi pokročilé a už dlho sa používajú v mikrobiológii, stále však nie sú akceptované európskou verejnosťou.

Priemyselný význam

Celková hmotnosť dnes vyprodukovaných kvasiniek, vrátane tých z pivovarníctva, vinárstva a výroby potravín, je milióny ton ročne. Aj keď kvasinky druhu Saccharomyces cerevisiae predstavujú základnú, ekonomicky významnú formu, existuje veľa „exotických“ druhov kvasiniek s ďalším potenciálnym využitím pre technické aplikácie. Väčšina Saccharomyces-Kvasinky sú všeobecne uznávané na celom svete ako bezpečné z hľadiska potravinového práva (GRAS - všeobecne uznávané ako bezpečné) a produkujú dva veľmi dôležité produkty primárneho metabolizmu, etanol a oxid uhličitý.

Etanol sa používa ako alkohol, ako palivo a ako rozpúšťadlo. Použitie oxidu uhličitého sa pohybuje od kysnutia cesta, prísad do nápojov, výroby chmeľového extraktu po použitie v skleníkových kultúrach. Existujú aj ďalšie dôležité aplikácie samotných kvasiniek: Kvasinkové extrakty sa používajú na dochutenie jedál a ako zdroj nukleotidov sú dôležitou súčasťou náhrad materského mlieka. Kvasinky slúžia ako zdroj vitamínu B pre ľudí a zvieratá. Sterilné kvasnicové extrakty slúžia ako zložky živných médií na kultiváciu húb pri výrobe enzýmov alebo na výrobu baktérií pre probiotiká a silážne látky.

Štruktúra bunkovej steny niektorých Saccharomyces-Druhy je možné špecificky regulovať prostredníctvom odchovného prostredia (riadenie fermentácie, výživa), vďaka čomu sú tieto organizmy veľmi populárne v biotechnologickom priemysle. Ukázalo sa, že mriežkovitá glukánová frakcia bunkovej steny niektorých kmeňov má vlastnosti viažuce toxíny. Definované mannanoproteíny umožňujú boj proti patogénnym baktériám alebo slúžia ako orálne „propagátory“ vakcín a liekov, ktoré by mohli byť zaujímavé aj pre výživu zvierat. Dobre popísaná nutričná syntéza kvasiniek umožňuje produkciu aminokyselín a organicky viazaných stopových prvkov pre výživu ľudí a zvierat. Využitie genetického inžinierstva viedlo k mnohým ďalším dôležitým aplikáciám kvasiniek, vrátane kmeňov, ktoré genetickou modifikáciou produkujú nekvasinkové proteíny a peptidy, ako je interferón, ľudský sérový albumín alebo inzulín.

Výhody kvasníc ako „expresných platforiem“

Kvasinky pozostávajú z veľkého množstva veľmi odlišných organizmov, nielen z pekárskych alebo pivovarských kvasníc, ktoré sú všeobecne známe z pečenia a varenia. Saccharomyces cerevisiae.

Kvasinky sú ideálne systémy na výrobu cudzích proteínov. Ako eukaryoty sú schopné glykozylovať proteíny, takže sú schopné pripájať k proteínom cukrové reťazce: veľa proteínov sú glykoproteíny. Sú tiež schopné vylučovať tieto glykoproteíny do živného média, ktoré ich obklopuje - do črevných baktérií E. coli nemôže to urobiť napr. Proteíny produkované v kvasinkách sú preto identické alebo veľmi podobné proteínom zvierat alebo ľudí.

Prvá „expresná platforma“ („továreň na výrobu bielkovín“) založená na druhu kvasníc používala už spomínané pekárske droždie. Existuje však viac ako 800 rôznych druhov kvasiniek s veľmi odlišnými vlastnosťami. Na rozdiel od pekárskych kvasníc sa niektoré z nich neobmedzujú iba na glukózu ako zdroj uhlíka pre svoj rast, ale môžu používať rôzne rôzne substráty. Rôzne z týchto kvasiniek sa používajú - napríklad pekárske kvasinky - na genetické inžinierstvo bielkovín.

Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans)

Arxula adeninivorans je dimorfný kvasinkový typ (rastie v kvasinkovej forme pod teplotou 42 ° C, nad túto teplotu vo vláknitej forme). Môže rásť na veľmi rozdielnych zdrojoch energie a uhlíka a asimilovať dusičnany. Používalo sa na výrobu rôznych bielkovín. Geneticky modifikované kmene sa použili na výrobu biologicky odbúrateľného plastu alebo biosenzorov na meranie estrogénov vo vzorkách životného prostredia.

Candida boidinii

Candida boidinii je metylotrofný druh kvasiniek (tj. schopný rastu oxidáciou metanolu ako zdrojom energie a metanolom ako zdrojom uhlíka). Rovnako ako ostatné metylotrofné kvasinky (pozri nižšie Hansenula polymorpha a Pichia pastoris) ponúka vynikajúcu platformu na produkciu cudzích proteínov. Boli pre nich opísané produktivity mnohých gramov na liter kultúry.

Hansenula polymorpha (Pichia angusta)

Hansenula polymorpha je metylotrofný druh kvasiniek (pozri Candida boidinii). Môže tiež rásť na rôznych ďalších substrátoch, je termo-tolerantným mikroorganizmom a dokáže asimilovať dusičnany. Okrem iného sa používal na výrobu vakcín proti hepatitíde B, inzulínu a interferónu-alfa2a na liečbu hepatitídy C, ako aj na výrobu rôznych technických enzýmov.

Kluyveromyces lactis

Kluyveromyces lactis je druh kvasníc, ktorý sa používa na výrobu kefíru. Môže rásť na rôznych cukroch, obzvlášť dôležitý je cukor laktóza, ktorý sa nachádza v mlieku a srvátke. Po genetickej modifikácii sa okrem iného používal na výrobu chymozínu, syridla, na zrážanie mlieka pri výrobe syra. Výroba chymozínu sa uskutočňuje vo veľkých fermentoroch v 40 000 litrovom meradle.

Pichia pastoris

Pichia pastoris je ďalší typ metylotrofných kvasiniek (porov. Candida boidinii a Hansenula polymorpha). Pre túto „platformu“ sú k dispozícii rôzne prvky ako súpravy; používa sa na celom svete na univerzitách a akademických inštitúciách na výrobu bielkovín. V poslednej dobe boli vyvinuté kmene, vďaka ktorým sú komplexné cukrové reťazce ľudských proteínov úplne autentické (kvasinkové cukrové reťazce v kvasinkových proteínoch sú zvyčajne podobné, ale nie úplne identické).

Saccharomyces cerevisiae

Pojem „droždie“ je kolektívny pojem, ale často sa používa iba pre tento druh kvasníc, tradičné pekárske alebo pivovarské kvasnice. Saccharomyces cerevisiae, používa sa, pretože to je pôvodný význam slova „droždie“. Saccharomyces cerevisiae sa používala a používa sa okrem iného na výrobu technických enzýmov, ale aj aktívnych farmaceutických zložiek, ako sú vakcíny proti inzulínu a hepatitíde B.

Yarrowia lipolytica

Yarrowia lipolytica je dimorfný typ kvasiniek (porov. Arxula adeninivorans), ktoré, rovnako ako iné druhy, ktoré už boli opísané, môžu rásť na rôznych podkladoch. Má veľký potenciál pre priemyselné použitie, ale zatiaľ neexistuje žiadny komerčne dostupný produkt genetického inžinierstva, ktorý by bol vyrobený pomocou tejto kvasinky.

Porovnanie rôznych kvasiniek

Rôzne druhy kvasiniek sa pri vývoji niektorých produktov značne líšia. Okrem toho sa z takzvaných divokých typov musia najskôr stať „továrne na genetické bielkoviny“. Vhodné kmene kvasiniek sa musia transformovať pomocou vektora (konkrétne: pomocou plazmidu). Taký plazmid obsahuje všetky potrebné genetické prvky na rozpoznanie transformovaného kmeňa a genetické vedenie pre produkciu požadovaného proteínu. Tieto prvky sú stručne zhrnuté nižšie:

Marker selekcie, ktorý je nevyhnutný na rozlíšenie transformovaného kmeňa od netransformovaných kmeňov - to sa dá dosiahnuť napríklad genetickým prvkom, ktorý umožňuje spätnému rastu defektného kmeňa v médiu, v ktorom chýba nevyhnutná látka že samotný kmeň už nemôže produkovať kvôli svojmu defektu, ako je napríklad určitá aminokyselina.
Niektoré prvky na rozmnoženie plazmidov po požití alebo na ich zabudovanie do špecifického miesta kvasinkového chromozómu (sekvencia ARS a/alebo rDNA).
Segment DNA, ktorý je zodpovedný za syntézu požadovaného proteínu, sa nazýva expresná kazeta. Takáto „kazeta“ pozostáva zo sekvencie regulačných sekcií: v prvom rade obsahuje promótor, ktorý riadi, v akom rozsahu a za akých okolností sa číta následná sekvencia (transkripcia mRNA), a teda koľko a za akých okolností sa produkuje proteín sa stáva.

To znamená, že nasledujúca postupnosť je premenlivá podľa látky, ktorá sa má vyrobiť. Môže napríklad určiť aminokyselinovú sekvenciu pre inzulín, povrchové antigény hepatitídy B alebo interferón. Expresná kazeta je ohraničená následnou terminátorovou sekvenciou, pomocou ktorej je transkripcia správne ukončená. Promótorové prvky na riadenie transkripcie pochádzajú z veľmi aktívnych génov jednotlivých druhov kvasiniek Hansenula polymorpha napríklad z génov metabolizmu metanolu. Sú silné a dajú sa regulovať aj pridaním určitých zdrojov uhlíka do kultivačného média. Väčšina promotérov, rovnako ako práve uvedení, funguje iba v jednom systéme, konkrétne v tom, z ktorého pochádzajú.

Zistilo sa, že rôzne druhy kvasiniek sa veľmi líšia svojou schopnosťou produkovať určité bielkoviny. Existujú rozdiely v spracovaní a úprave a vo všeobecnosti v produktivite. Pretože sa líšia, nemožno vylúčiť, že droždie špecifikované na začiatku procesu a vývoja produktu nemusí byť schopné vyrobiť požadovanú látku vôbec alebo iba neúplne. To zase môže mať nákladné a časovo náročné následky. Preto má zmysel skontrolovať na začiatku vývoja niekoľko druhov kvasiniek súčasne, či sú schopné produkovať určitý proteín. Na tento účel bol vyvinutý vektorový systém, ktorý je funkčný vo všetkých doteraz skúmaných kvasinkách. Má modulárnu štruktúru a obsahuje „univerzálnu“ cieľovú sekvenciu, ktorá je prítomná v identickej sekvencii vo všetkých kvasinkách (rDNA). Vo vnútri expresnej kazety obsahuje promótor, ktorý je aktívny vo všetkých kvasinkách.

Kvasinky vo výžive zvierat

Okrem použitia piva alebo pivovarských kvasníc v usmrtenej forme ako vysoko dostupného zdroja bielkovín sa asi 20 rokov používajú aj špecifické kmene. Saccharomyces cerevisiae používané vo výžive zvierat ako probiotiká. Triumfálny pokrok tejto formy aplikácie, najmä v sektore prežúvavcov, sa vracia k dôležitému pozorovaniu pivovarníckeho priemyslu: Na stabilizáciu hotového zeleného piva používajú pivovarníci v procese „nafukovania“ malé množstvo droždia, ktoré spotrebováva zvyškový kyslík. V tejto súvislosti popísal v roku 1965 tento kmeň britský vedec v odbore pivovarníctva James Hough S. cerevisiae NCYC 1026 neobvykle vysoká aktivita spotrebujúca kyslík. Jeho študent, írsky pivovarnícky inžinier Pearse Lyons, použil toto pozorovanie prvýkrát komerčne v roku 1980 na stabilizáciu anaeróbneho stavu v bachore kráv. Dnes je použitie živých kultúr kvasiniek pri kŕmení prežúvavcov a koní štandardom na celom svete.

Ďalšie účinky týkajúce sa úžitkovosti a zdravia zvierat možno vysledovať späť k vlastnostiam živých kvasiniek, ktoré určujú životné prostredie a stimulujú baktérie. Rôzne baktérie degradujúce vlákninu a laktát degradujúce reagujú na prítomnosť kvasiniek zvýšením ich metabolizmu a reprodukčných aktivít. Použité vlastnosti sú opäť špecifické pre jednotlivé kmene Saccharomyces. Známe sú aj kmene s protichodnými účinkami, ako je stimulácia laktátotvorných látok.

výhľad

Hľadanie budúcich aplikácií kvasiniek vo výžive zvierat sa zameriava na výrobu prírodných hemiceluláz a celuláz na výrobu kvalitnejších proteínov a jednotlivých aminokyselín z lacných surovín, ako sú ryžové šupky alebo vedľajšie produkty z alkoholového priemyslu. Medzi ďalšie oblasti patrí výroba peptidov na vyvážené kŕmenie mladých zvierat v zmysle „ideálnych bielkovín“ a použitie kvasinkových bielkovín ako základu pre chelatačné lieky a stopové prvky. Pestovanie a výroba kvasiniek požadovaného typu si vyžaduje veľa know-how, je však veľmi všestranné a predovšetkým veľmi bezpečné. Saccharomyces cerevisiae a ich príbuzní preto budú ľudstvo sprevádzať ešte dlho.