Leptín ovplyvňuje obrat črevných epitelových buniek v korelácii s expresiou leptínového receptora

obrat

  • abstraktné
  • Hlavná
  • MATERIÁLY A METÓDY
  • Zvieratá.
  • Experimentálny dizajn.
  • Chirurgická procedúra.
  • Parametre úpravy čreva.
  • Histologické vyšetrenie.
  • Mikrodisekcia laserom a príprava RNA.
  • RT-PCR.
  • PCR v reálnom čase.
  • Proliferácia kryptových buniek a apoptóza enterocytov.
  • Expresia génov Bax a Bcl-2.
  • Štatistická analýza.
  • VÝSLEDKY
  • Parametre úpravy čreva.
  • Proliferácia enterocytov a apoptóza v jejune.
  • Dlhá forma expresie LEPr a premeny enterocytov v ileálnych kryptách.
  • Dlhá forma expresie LEPr a apoptózy enterocytov v ileálnych klkoch.
  • Expresia génov súvisiacich s apoptózou.
  • DISKUSIA
  • glosár

abstraktné

Rozsiahle štúdie na rôznych experimentálnych modeloch syndrómu krátkeho čreva (SBS) preukázali, že apoptóza enterocytov hrá rozhodujúcu úlohu pri adaptácii čreva po resekcii (1, 2). Napriek potrebe intestinálnej hyperplázie nemôžu mitotické stimuly potlačiť programovanú bunkovú smrť (3). Mnoho vedcov opísalo zvýšenú apoptózu enterocytov ako mechanizmus, ktorý kompenzuje zvýšenú proliferáciu enterocytov na dosiahnutie novej homeostatickej rýchlosti počas úpravy čreva (4). Zvýšená apoptóza podporuje likvidáciu geneticky aberantných kmeňových buniek a zabraňuje vývoju nádoru (3, 4).

Adaptácia čreva po intestinálnej resekcii vedie k zvýšenej proliferácii črevných epiteliálnych buniek, ako aj k zvýšenej programovanej smrti buniek, čo naznačuje zrýchlený obrat buniek. Výsledok týchto opatrení pomáha pretvárať štruktúry klkov krypty na podlhovastejšie a funkčne aktívnejšie jednotky. Regulácia rovnováhy medzi produkciou buniek a stratou buniek apoptózou po resekcii čreva je zložitá a presné faktory, ktoré vedú tento adaptačný proces, zostávajú nejasné (11, 12). Najmä nie je jasné, kde mnohé z týchto trofických faktorov pôsobia pozdĺž osi krypta-villus. Posledné zistenia naznačujú, že rôzne rastové faktory, ako je rastový faktor keratinocytov (13) a epidermálny rastový faktor (14), sú vyjadrené rôzne pozdĺž osi krypta-vilus. To naznačuje, že rôzne trofické faktory môžu pôsobiť na rôznych miestach pozdĺž tejto osi. Nedávno sme demonštrovali, že TGF-alfa (TGF-α) simuluje premenu enterocytov na základe expresie receptora epidermálneho rastového faktora pozdĺž osi villus-crypt (15).

Obézny génový proteínový produkt leptín (LEP) sa vylučuje z adipocytov a pôsobí primárne na hypotalamus, ktorý reguluje výdaj energie, príjem potravy a telesnú hmotnosť (16). Aj keď črevo nie je klasickým cieľovým tkanivom pre LEP, rozsiahle štúdie na rôznych experimentálnych modeloch preukázali, že LEP určuje dôležité fyziologické účinky na črevný rast, dozrievanie a diferenciáciu buniek (17, 18). V našej predchádzajúcej práci sme preukázali, že LEP stimuluje adaptáciu čreva po masívnej resekcii tenkého čreva u potkana (19). Málo sa však vie o mechanizmoch, ktoré stoja za týmto pozitívnym účinkom.

Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať účinky LEP na premenu enterocytov (proliferáciu a apoptózu) v súvislosti s expresiou LEP receptora (LEPr) pozdĺž osi villus-crypt po masívnej resekcii tenkého čreva u potkanov.

MATERIÁLY A METÓDY

Zvieratá.

Inštitucionálny výbor pre starostlivosť a použitie zvierat lekárskej fakulty Rappaport (Technion, Haifa, Izrael) schválil zariadenia a protokoly pre zvieratá. Samce dospelých potkanov Sprague-Dawley s hmotnosťou 240 až 260 g boli chované v jednotlivých klietkach z nehrdzavejúcej ocele pri konštantnej teplote a vlhkosti a bol udržiavaný 12 hodinový cyklus svetlo-tma. Krysy boli pred experimentom 12 hodín hladované bez prístupu vody. Celková anestézia bola zahájená ketamínom (ip 90 mg/kg) a xylasínom (ip 15 mg/kg).

Experimentálny dizajn.

40 potkanov bolo náhodne rozdelených do jednej z troch skupín: skupina A, fingované potkany boli podrobené intestinálnej transekcii (fingovaná, n = 14); Skupina B, SBS zvieratá podstúpili resekciu čreva (SBS, n = 13); a skupina C, potkany SBS-LEP podstúpili resekciu čreva (SBS-LEP, n = 13) a boli liečení LEP v ip dávke 50 mg/kg od d4 do d14.

Chirurgická procedúra.

Potkany podstúpili jeden z dvoch chirurgických zákrokov: intestinálnu transekciu, po ktorej nasledovala reanastomóza alebo 75% resekcia čreva. Použitím sterilných techník sa brucho otvorilo rezom v strednej línii. U fingovaných potkanov bolo stredné tenké črevo prerušené a znovu zostavené bez resekcie čreva. U SBS zvierat sa uskutočnila 75% resekcia v strede tenkého čreva, podobná tej, ktorá bola opísaná vyššie. Spočívalo to v resekcii čreva medzi 5 cm distálne od von Treitzovho väzu a 10 cm proximálne od ileocekálnej chlopne. Kontinuita hrubého čreva sa obnovila end-to-end anastomózou pomocou 6-0 vstrebateľných stehov (Vicryl, Ethicon Corporation, USA). Pri všetkých operáciách bola brušná dutina uzavretá v dvoch vrstvách bežiacim stehom 3/0 Vicryl (Ethicon Corporation, USA). Pooperačné potkany dostali vodu ad libitum a tekutú stravu. Potkany sa utratili 15. deň ip injekciou pentobarbitalu (75 mg/kg).

Parametre úpravy čreva.

Tenké črevo bolo rýchlo odstránené, prepláchnuté studeným izotonickým soľným roztokom a rozdelené do dvoch segmentov: jejunum proximálne k anastomóze a terminálne ileum. Hrubé črevo sa rozdelilo na antimesenterickom okraji, premylo sa studeným soľným roztokom, vysušilo sa a každý segment sa zvážil. Sliznica bola zoškrabaná z podkladového tkaniva špachtľou (Sigma Chemical Co., Izrael). Vzorky sliznice sa homogenizovali s činidlom TRIzol. DNA a proteín boli extrahované Chomczynského metódou (20) a vyjadrené ako mikrogramy na centimeter čreva na 100 gramov telesnej hmotnosti.

Histologické vyšetrenie.

Histologické rezy boli vyrobené z proximálneho jejuna, distálneho ilea a porovnateľných miest u kontrolných zvierat. Segmenty tenkého čreva sa fixovali v 10% formalíne počas 24 hodín a spracovali sa do štandardných parafínových blokov. Päť mikrónové tkanivové rezy boli zafarbené hematoxylínom a eozínom. Výška klkov a hĺbka krypty sa merali pomocou softvéru na analýzu obrazu Image Pro Plus 4 (Media Cybernetics, Baltimore, MD). Zmeralo sa desať klkov a krýpt v každej časti a priemerná hodnota sa zaznamenala do mikrometrov.

Mikrodisekcia laserom a príprava RNA.

Rezy s hrúbkou 15 mikrometrov sa pripevnili na špeciálne podložné podložné sklíčka bez RNázy a UV ošetrené membránou (PALM Technologies, Bernried, Nemecko) a okamžite sa fixovali v ľadovom 70% etanole po dobu 2 minút. Po inkubácii po dobu 60 s v 1% krezylfialacetáte sa rezy dehydratovali v etanolovej sérii (70 a 100% na ľade) a nechali krátko vysušiť na vzduchu. Sklíčka sa skladovali pri -80 ° C až do mikrodisekcie. Rezy sa rezali laserom do 3 dní. Sklíčka boli pozorované pomocou inverzného laserového mikroskopu Zeiss Axiovert 200 M a vizualizované na monitore pomocou softvéru PALM Robo. Špičky klkov, bočné klky a krypty sa oddelili pomocou laseru. RNA sa extrahovala s použitím RNeasy Microkit (Qiagen) a mikrodisekčného protokolu. Všetky vzorky sa skladovali pri -80 ° C na dlhodobé skladovanie.

RT-PCR.

Kvalita RNA sa hodnotila pomocou automatizovaného elektroforetického systému Experion (BioRad). Päť mikrogramov RNA bolo prevedených na cDNA pri 37 ° C s použitím 200 uM deoxynukleotidov (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 5 uM náhodných hexamérov (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 20 U RNAguard (Amersham Pharmacia Biotech) transkribovaná) a 200 U/ul reverznej transkriptázy vírusu Moloneyovej myšej leukémie (US Biochemicals, Cleveland, OH). Nastavenia tepelného cyklovača boli optimalizované tak, aby sa zabezpečilo, že výrobky sú vo fáze lineárnej výroby.

PCR v reálnom čase.

Expresia dlhej formy hladín LEPr bola stanovená kvantitatívnou PCR v reálnom čase na vzorkách cDNA pomocou súpravy TaqMan assay on demand (ABsolute Blue QPCR ROX Mix (ROX dye) od ABgene, Epsom, UK). ABI-PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Jednoduché exónové priméry (od PrimerDesing Ltd, UK) s odstupom 3'UTR-1064 bp (sense primer, GCAGGGCTGTATGTCATTGTA; antisense primér, GAACATGGTCCCAAAACAACTT) boli vyvinuté tak, aby produkovali amplikón 109 bp. 18S (5'AGGAATTGACGGAAGGGCAC, 3'GTGCAGCCCCGGACATCTAAG) sa použil na prístup k rovnakému obsahu cDNA pre každý oddiel. Priméry sú špecifické pre dlhú formu LEPr a nie sú v rovnakom exóne; Inak nemožno amplifikáciu kontaminujúcej DNA odlíšiť od amplifikácie cDNA.

Proliferácia kryptových buniek a apoptóza enterocytov.

Potkanom sa 2 hodiny pred usmrtením injektovalo štandardné značkovacie činidlo 5-brómdeoxyuridínu (5-BrdU) (Zymed Lab, Inc, CA) v dávke 1 ml na 100 g telesnej hmotnosti. Tkanivové rezy (5 um) boli odparafínované xylénom, rehydratované odstupňovaným alkoholom a zafarbené biotinylovaným anti-BrdU monoklonálnym protilátkovým systémom pomocou súpravy na farbenie BrdU (Zymed Lab, Inc, CA). Proliferačný index sa stanovil ako pomer kryptových buniek, ktoré sa zafarbili pozitívne na BrdU na 10 krypt.

Ďalších 5? Rezy boli hrubé na stanovenie stupňa apoptózy enterocytov. Imunohistochémia pre kaspázu-3 (koncentrovaná polyklonálna protilátka natrávená kaspázou-3; zriedenie 1: 100; Biocare Medical, Walnut Creek, CA) sa uskutočňovala na zameranie apoptotických buniek pomocou kombinácie streptovidín-biotín-peroxidázová metóda podľa protokolov Identifikujte výrobcu. Expresia apoptózy epitelových buniek sa vyjadruje ako celkový počet apoptotických buniek pozdĺž tejto osi na 10 klkov a 100 krypt. V niektorých prípadoch bola pomocou predtým zavedených techník vykonaná podrobnejšia analýza polohy apoptózy (21). Na tento účel sa apoptóza pozdĺž klkov rozlišovala medzi dolnou tretinou klkov (bočné klky) a hornou tretinou klkov (hroty klkov). Apoptóza sa zaznamenávala ako počet apoptotických buniek na 10 klkov. Kvalifikovaný patológ, nevidiaci zdroj črevného tkaniva, vykonal všetky merania.

Expresia génov Bax a Bcl-2.

Celková RNA sa izolovala zo zmrazených vzoriek sliznice (proximálne jejunum a distálne ileum) s použitím činidla TRIzol (GIBCO BRL, USA), ako opísal Chomczynski (20). Časť celkovej RNA (2 ug v celkovom objeme 25 ul) sa obrátila pomocou súpravy na syntézu cDNA s prvým vláknom vírusu Moloney Murine Leukemia (MMLV) (Gene Choice, Inc. Frederick, MD). prepísané. Po PCR bol amplifikovaný produkt (5 ul) nanesený na 2% agarózový gél zafarbený etídiumbromidom a fotografovaný. Úroveň expresie génov Bax a Bcl-2 bola vyjadrená ako pomer hustoty šedej cieľového génu k hustote šedej 18S v denzitometrii. Sekvencie pre špecifické gény boli nasledovné: Bax 5 'ATGGACGGGTCCGGGGAGCA, 3'ATGGACGGGTCCGGGGCACA, Bcl-2 5'TGAGGCCCTGTCTGCTTCTG, 3'AGGCTCCCGGGGCCTCTCGA (všetky priméry boli vyššie ako Ald Chem. Da 18Sma). Keď sa exprimuje väčšina mRNA, priméry 18S rRNA sa zriedili 1:10, aby sa produkty RT-PCR dostali do rovnakého rozsahu exponenciálnej amplifikácie.

Štatistická analýza.

Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM. Na štatistickú analýzu s hodnotou p sa použil jednosmerný test ANOVA nasledovaný Bonferroniho post hoc testom

črevných

Vzťah medzi expresiou mRNA leptínového receptora (B) a proliferáciou enterocytov (A) a apoptózou (C) v kryptách po masívnej resekcii tenkého čreva a liečbe leptínom. Hodnoty sú priemery ± SEM. Zväčšenie 1: 100. * s

ovplyvňuje

Účinok resekcie čreva a liečba leptínom na apoptózu enterocytov (B) v korelácii s expresiou leptínového receptora (A) vo špičkách klkov a v laterálnych klkoch. Hodnoty sú priemery ± SEM. Zväčšenie 1: 100. * s

črevných

Vplyv resekcie čreva a liečby leptínom na expresiu Bax a Bcl-2 vo vzorkách sliznice ilea. Hodnoty sú priemery ± SEM. * str. Morfologické zmeny zahŕňajú predĺženie klkov a prehĺbenie krýpt, zvýšenú proliferáciu enterocytov a zvýšenú migráciu enterocytov pozdĺž klkov. Funkčná adaptácia vedie k zvýšenému príjmu živín izolovanými enterocytmi (21–23).

Hlavnou chybou štúdie je, že sa analyzujú iba hladiny mRNA dlhej formy LEPr. Na vyhodnotenie expresie ďalších foriem LEPr, o ktorých je známe, že existujú v rôznych tkanivách potkanov, sú potrebné ďalšie experimenty.

V súhrne možno povedať, že liečba LEP stimuluje intestinálny rast na potkaních modeloch SBS. Zvýšená expresia mRNA LEPr pozdĺž osi villus-krypta by mohla naznačovať dôležitú úlohu LEP pri modulácii apoptózy enterocytov v gastrointestinálnej sliznici. Účinok LEP na premenu enterocytov silne koreluje s dlhou formou expresie LEPr pozdĺž osi vili-krypta.