Lokálna proliferácia vedie pri obezite k hromadeniu makrofágov v tukovom tkanive

predmetov

abstraktné

Akumulácia makrofágov v tukovom tkanive (ATM) je významným znakom chronického zápalu spojeného s obezitou. Je tiež dôležitý pri regulácii vývoja obezity. U chudých zvierat existuje malý počet rezidentných buniek ATM distribuovaných medzi adipocyty považované za M2 makrofágy. V prípade obezity sa významne zvýšené makrofágy hromadia v tukovom tkanive a vytvárajú okolo mŕtvych adipocytov takzvanú „Crown-like Structure“ (CLS). 1, 2 Tieto makrofágy majú fenotyp M1 a produkujú rôzne typy zápalových cytokínov, ako je TNF-ag; čo vedie k šíreniu zápalu v dôsledku obezity a rozvoju metabolických porúch, ako je inzulínová rezistencia. 3, 4, 5

Na akumulované bankomaty sa tradične pozerá ako na výsledok migrácie periférnych monocytov za zápalových podmienok. V poslednej dobe rastúce dôkazy ukazujú, že udržiavanie tkanivových makrofágov je pravdepodobne nezávislé na doplňovaní cirkulujúcich monocytov a dokonca nezávislé na prekurzoroch kostnej drene. 6 V skutočnosti sú rôzne typy tkanivových makrofágov schopné obnoviť sa a lokálne sa množiť v naivnom stave, ako sú mikroglie, 7, 8, Kupfferove bunky, 9 a Langerhansove bunky. V akútnom zápalovom stave, napríklad počas parazitickej infekcie, sa zvyšuje lokálna proliferácia makrofágov a tieto makrofágy vykazujú fenotypy alternatívne aktivovaných makrofágov, čo je proces riadený Th2 cytokínmi. 11 Pri chronických zápalových stavoch, ako je artérioskleróza, dochádza tiež k lokálnej proliferácii makrofágov, čo prispieva k hromadeniu makrofágov v arteriálnych stenách. 12 Nedávno sa zistilo, že lokálne množenie makrofágov môže prispieť k akumulácii obezity v bankomatoch. 13, 14

Výsledky

Hromadenie bankomatov v počiatočných štádiách obezity súvisí s množením makrofágov

Akumulácia makrofágov v tukovom tkanive je spojená s proliferáciou in situ v počiatočných štádiách obezity. ( a ) Telesné hmotnosti myší kŕmených ND a HFD (n = 10 myší v každej skupine). Chybové stĺpce predstavujú stredné hodnoty ± SEM *** P + ATM v eAT z myší na ND alebo HFD. Mierka, 100 μm

Počiatočné štádium genetickej obezity je spojené s množením bankomatov

Obezita je výsledkom komplexných interakcií medzi génom a prostredím. Na modeli geneticky dedičnej obezity sme myši s deficitom leptínového receptora (myši lepry db/db, všeobecne označované ako db/db), skúmali nielen obezitu súvisiacu so stravou, ale aj to, či proliferácia makrofágov in situ v bankomate Zahŕňa to akumuláciu. db myši). Zistili sme, že akumulácia ATM v tukových tkanivách (eAT a iAT) myší lepry db/db v počiatočných štádiách obezity (starých 7 týždňov) dramaticky rastie v porovnaní s akumuláciou ich heterozygotných súrodencov (2a). Medzitým boli makrofágy Ki67 + výrazne zvýšené v tukovom tkanive 7-týždňových myší db/db lepry (2b). Vykonali sme tiež test začlenenia EdU a zistili sme, že v počiatočných štádiách genetickej obezity (10 týždňov starých) bolo v tukovom tkanive malomocných myší db/db pozorované signifikantne viac makrofágov začlenených do EdU (obrázky 2c a d). Percento bankomatov začlenených do EdU od myší s pokročilou genetickou obezitou (30 týždňov staré) bolo tiež významne vyššie ako u chudých spolužiakov. Proliferácia makrofágov teda prispieva k akumulácii ATM pri genetickej obezite.

Pre porovnanie sme ďalej analyzovali chimérickú hladinu eozinofilov v tukovom tkanive. Eozinofily sú ďalšou podskupinou myeloidných buniek, u ktorých sa preukázalo, že migrujú z periférnej krvi do tukového tkaniva a hrajú dôležitú úlohu pri udržiavaní homeostázy glukózy, 15 ktoré sa u obéznych alebo chudých myší nerozmnožujú (doplňujúce obrázky S1a a b). ). . Na rozdiel od ATM boli zjavné eozinofily pochádzajúce od darcu (CD45.1 +) pozorované v tukovom tkanive obéznych myší v počiatočných štádiách (8-týždňový HFD) aj v neskorom štádiu (12-týždňový HFD) (obrázok 3d)). Z tohto dôvodu sme potvrdili, že akumulácia ATM je vyvolaná proliferáciou rezidentných makrofágov v ranom štádiu obezity a ďalej podporovaná migráciou monocytov v neskorom štádiu obezity.

Položili sme tiež zaujímavú otázku: je sila množenia makrofágov obmedzená iba na domáce bankomaty, alebo ju možno pozorovať aj v prijatých makrofágoch? Aby sme to napravili, uskutočnili sme test začlenenia EdU na chimérických myšiach kŕmených HFD po dobu 12 týždňov. Je zaujímavé, že ATM vložené do CD45.2 + aj CD45.1 + -Edu boli detekované v tukovom tkanive (obrázok 3e), čo naznačuje, že makrofágy proliferujú bez ohľadu na ich pôvod. Lokálne množenie rezidentných aj regrutovaných makrofágov teda prispieva k hromadeniu bankomatov.

CCL2 nie je potrebný na akumuláciu makrofágov v počiatočných štádiách obezity

Aby sme podporili záver, že proliferácia, nie migrácia monocytov, hrá rozhodujúcu úlohu pri akumulácii ATM pri včasnej obezite, analyzovali sme lokálnu expresiu CCL2 (MCP-1) v tukovom tkanive, ktoré je hlavným chemoatraktantom pre migráciu monocytov je. Je zaujímavé, že pri intracelulárnom farbení sme zistili, že CCL2 bol exprimovaný hlavne CD45 - CD31 - stromálnymi bunkami v tukovom tkanive a nie CD45 + leukocytmi alebo CD31 + endotelovými bunkami. V skutočnosti nebola v žiadnej z troch populácií buniek odvodených z tukového tkaniva obéznych myší pozorovaná zvýšená expresia CCL2 v porovnaní s expresiou štíhlych myší (obr. 4a). V dôsledku toho sa hladina CCL2 v sére nezmenila v počiatočných štádiách obezity (obrázok 4b). V neskoršom štádiu obezity (HFD> 12 týždňov) sa však v sére zistila významne vyššia hladina CCL2 (obrázok 4c). Tieto výsledky ukazujú, že migrácia monocytov vyvolaná CCL2 nie je určujúcim faktorom pre akumuláciu ATM v počiatočnom štádiu obezity, zatiaľ čo dokáže regulovať akumuláciu ATM v relatívne neskoršom štádiu obezity.

Proliferatívne bankomaty sú výhodne umiestnené v CLS. ( a ) Imunofluorescencia ukazujúca lokalizáciu Ki67 + ATM u obéznych myší indukovaných HFD. Šípky označujú bankomaty mimo CLS. Mierka, 100 μm. ( ) Percento ATM Ki67 + v CLS a mimo CLS, kde bolo 225 ATM kombinovaných zo 7 imunofluorescenčných snímok. *** P + bankomaty sa postupne znižovali spolu s progresiou obezity. Podrobná analýza ukázala, že expresia RELM- & agr; v bankomatoch Ki67 + je oveľa nižšia v porovnaní s bankomatmi Ki67 + (doplnkový obrázok S2). TNF-? + Bankomaty sa najskôr zvyšovali a potom znižovali, ako obezita postupovala. Percento Ki67 + TNF- & agr; + ATM je porovnateľný s bankomatom Ki67 - TNF- & agr; + Bankomaty (doplnkový obrázok S3).

Signalizácia IL-4/STAT6 je hlavným motorom šírenia bankomatov

Ďalej sme skúmali mitogénne stimuly pre proliferáciu ATM. Ukázalo sa, že IL-4, 11 M-CSF, 12 a CCL2 13 môžu riadiť lokálnu proliferáciu makrofágov. Keď sme však skúmali účinky týchto cytokínov na proliferáciu ATM, zistili sme, že iba podanie IL-4 môže zvýšiť proliferáciu ATM u chudých myší. 19 Keď bol IL-4 injikovaný intraperitoneálne do chudých myší, bolo pozorované dramatické zvýšenie Ki67 + ATM (obrázok 6a). Po naviazaní na svoj receptor aktivuje IL-4 JAK1 a JAK3 a potom vedie k fosforylácii STAT6, centrálneho transkripčného faktora pre biologické reakcie sprostredkované IL-4. 20 Zistili sme, že proliferácia ATM indukovaná IL-4 u myší s nedostatkom STAT6 bola vážne narušená (obrázok 6a), čo naznačuje kritickú úlohu signalizácie IL-4/STAT6 v ATM riadenom IL-4. - Označuje šírenie. Dôležitejšie je, že u myší s HFD bolo percento Ki67 + ATM u myší s nedostatkom STAT6 významne nižšie ako u myší WT (6b). Signalizácia IL-4/STAT6 je teda hnacou silou šírenia bankomatov pri obezite.

IL-4/STAT6 podporuje šírenie bankomatov. ( a ) Expresia Ki67 v ATM z eAT myší WT a STAT6 -/-, ktoré boli vystavené pôsobeniu komplexu protilátok proti IL-4 a IL-4 (na predĺženie biologickej dostupnosti IL-4 in vivo) alebo PBS po dobu 48 hodín boli liečené. ( ) Expresia Ki67 myší WT a STAT6 -/- na HFD v bankomatoch (n = 10 v každej skupine). Sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM

diskusia

S obezitou súvisí hromadenie bankomatov, ktoré šíria chronický zápal a podporujú inzulínovú rezistenciu. Predchádzajúce správy ukazujú, že migrácia krvných monocytov prispieva k infiltrácii makrofágov do zapálených miest. 1, 16, 21 Posledné dôkazy naznačujú, že miestne šírenie tiež hrá úlohu pri regulácii akumulácie ATM u obéznych ľudí. 13, 14 Príslušné príspevky týchto dvoch udalostí k akumulácii ATM počas progresie obezity sa však neriešili. V tejto štúdii sme ukázali, že proliferácia rezidentných makrofágov in situ určuje akumuláciu ATM v počiatočnom štádiu obezity, zatiaľ čo imigrantské monocyty prispievajú k akumulácii ATM v relatívne neskorom štádiu obezity. Okrem toho sa rezidentné aj regrutované makrofágy množia v tukovom tkanive obéznych myší (zhrnuté v 7).

Schematické znázornenie príspevku proliferácie makrofágov a náboru monocytov k akumulácii ATM pri obezite. U chudých myší sú rezidentné makrofágy v tukovom tkanive v nečinnosti a samyobnovovaním si udržiavajú základnú úroveň bunkovitosti. V počiatočných štádiách obezity sa tieto rezidentné makrofágy množia a vedú k akumulácii ATM, ktorá je riadená stimulmi, ktoré emitujú adipocyty a/alebo iné imunitné bunky. V neskorom štádiu obezity sa akumulácia ATM ďalej zvyšuje makrofágmi pochádzajúcimi z monocytov, ktoré majú tiež schopnosť proliferácie. Tieto proliferujúce makrofágy sa vždy lokalizujú v CLS a obklopujú apoptotické adipocyty. Červené jadrá naznačujú, že makrofágy sa množia

Predtým sa uvádzalo, že infiltrácia periférnych monocytov hrá dôležitú úlohu pri akumulácii obezity v bankomatoch. 1 Ako jeden z kľúčových chemokínov pri sprostredkovaní náboru monocytov sa navrhuje, aby CCL2 (MCP-1) sprostredkovávala akumuláciu ATM pri obezite. 16 Avšak iná správa ukazuje, že pri absencii CCL2 nebolo pozorované žiadne zníženie akumulácie makrofágov v tukovom tkanive. 22 Tieto kontroverzné výsledky naznačujú, že migrácia monocytov nie je jediným spôsobom regulácie akumulácie makrofágov v tukovom tkanive počas vývoja obezity.

Naše výsledky ukazujú, že rezidentné makrofágy sa hromadia v tukovom tkanive myší počas fázy chudnutia a včasnej obezity. Analýza fenotypu ATM počas progresie obezity odhalila, že vo fázach štíhlej a skorej obezity je prítomný značný počet alternatívne aktivovaných makrofágov. Avšak v neskorom štádiu obezity je tento typ makrofágov dramaticky redukovaný. Je zaujímavé, že sa uvádza, že alternatívne aktivované makrofágy zvyšujú kapacitu lipidového katabolizmu. 24, 25, 26 Alternatívne aktivované makrofágy v počiatočných štádiách obezity sú preto hlavnou populáciou makrofágov so špecializovanejším lipidovým katabolizmom ako imigrantské makrofágy.

V súhrne sme boli schopní určiť, že akumulácia makrofágov v tukovom tkanive počas obezity je vyvolaná proliferáciou rezidentných bankomatov in situ a je ďalej podporovaná koordinovanou aktiváciou migrácie monocytov a proliferácie makrofágov. Naše pozorovania poskytujú poznatky o vývoji zápalu spojeného s obezitou a môžu slúžiť ako pomôcka pre vývoj terapeutických stratégií pre poruchy spojené s obezitou.

Materiály a metódy

Testovanie na zvieratách

Myši C57BL/6 boli zakúpené v Šanghajskom laboratóriu pre zvieratá zvierat Čínskej akadémie vied (Šanghaj, Čína). Myši CD45.1 na pozadí C57BL/6 láskavo poskytol Dr. Yanyun Zhang z Ústavu zdravotníckych vied Čínskej akadémie vied. Heterozygotné myši s deficitom leptínového receptora (Lepr db/+) na pozadí C57BL/6 boli zakúpené v Centre pre výskum zvieracích modelov na univerzite v Nanjing (Nanjing, Čína) a chované v našom laboratóriu. Myši STAT6 -/- (C.129S2-Stat6 tm1Gru/J) pochádzali z Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Všetky experimenty boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používaním pri Ústave zdravotníckych vied Šanghajského ústavu pre biologické vedy Čínskej akadémie vied.

Obezita vyvolaná stravou sa uskutočňovala kŕmením 5 týždňov starých myší HFD obsahujúcim 60 kcal% tuku (D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA). Kontrolnej skupine bol podaný ND. Test zabudovania EdU sa uskutočňoval s použitím testovacích súprav Click-iT-EdU (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. Myšiam bolo podaných 10 um 3 hodiny pred usmrtením. g EdU/g telesnej hmotnosti injekčne ip. Click-iT reakcia sa uskutočňovala na tukovom tkanive a analyzovala sa prietokovou cytometriou a imunohistológiou. Na stanovenie príspevku rezidentných makrofágov k akumulácii ATM bolo dolné brucho anestetizovaných myší CD45.2 chránené 6 cm hrubým oloveným blokom. Týmto myšiam bola podaná radiačná dávka 9,5 Gy exponované a injikované iv 107 buniek CD45.1 kostnej drene. Chimérické myši sa nechali rekonštituovať 7 týždňov pred liečbou diétou. Na preskúmanie úlohy IL-4 v proliferácii ATM bola každej myši podaná kombinácia 5 ug. g IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) a 25 ug. g IL-4 protilátka (klon 11B11, Harlan) ip injikované bioprodukty pre Science, Indianapolis, IN, USA) alebo PBS a ATM analýza boli vykonané o 48 hodín neskôr.

Prietoková cytometria

EAT a iAT sa zhromaždili z usmrtených myší, nakrájali na malé kúsky a prepláchli sa PBS počas 1,5 hodiny 2 mg/ml kolagenázy I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) počas 1,5 hodiny. Plávajúce adipocyty sa oddelili centrifugáciou bunkovej suspenzie pri 600 x g počas 10 minút. Palety sa resuspendovali, prefiltrovali cez 70 um sitá a lyzovali červené krvinky. Bunková suspenzia sa predinkubovala s anti-CD16/CD32 (eBioscience, San Diego, CA, USA), aby sa blokovali Fc receptory pred zafarbením povrchovej molekuly. Intracelulárne farbenie sa uskutočňovalo pomocou fixačných a permeabilizačných súprav podľa pokynov výrobcu (eBioscience). Potkanie monoklonálne protilátky vrátane F4/80, CD45, CDllb, CD45.1, CD45.2, Ki67 a TNF-a pochádzali z eBioscience; CD115 a Siglec-F boli od Biolegend (San Diego, CA, USA).

Na intracelulárne farbenie RELM- & agr; a TNF-? 1: 1000 GolgiPlug (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) sa pridal ku kolagenáze počas trávenia tkanív v bankomatoch. Po zafarbení povrchovej molekuly sa uskutočnilo intracelulárne zafarbenie pomocou fixačnej súpravy a permeabilizačnej súpravy podľa pokynov výrobcu (eBioscience). Boli použité králičie anti-RELM-α (Abcam, Cambridge, MA, USA) a kozie anti-králičie IgG konjugované s Alexa Fluor 488 (Life Technologies).

Imunohistochémia

Tukové tkanivo sa rozrezalo na malé kúsky a zafixovalo sa 4% paraformaldehydom počas 24 hodín pri 4 ° C. Potom sa uskutočnilo úplné zafarbenie. Stručne, vzorky sa permeabilizovali 1% Triton X-100, blokovali sa 1% BSA a 3% FBS v PBS a potom sa inkubovali s príslušnými protilátkami na povrch alebo molekuly jadra. V niektorých experimentoch boli adipocyty kontrastne zafarbené BODIPY 558/568 C12 (Invitrogen).

Štatistická analýza

Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM a významnosť sa hodnotila nepárovým dvojstranným t-testom, pokiaľ nie je uvedené inak. Pozreli sme sa na P ATM

---