Metóda stanovenia hladiny tuku v protokole Drosophila založená na vztlaku (preložené do nemčiny)

Zhrnutie

Tu uvádzame metódu na meranie hladín tukov v organizme v larválnom instare (L3) larválneho instaru Drosophila melanogaster. Tento postup používa na rozlíšenie medzi larvami so zmeneným ukladaním tuku porovnateľne nízku hustotu tukového tkaniva. Analýza založená na vztlaku je cenným nástrojom na rýchle, reprodukovateľné a ekonomické zisťovanie.

Úvod

Postup vzniká nasledujúcim spôsobom, pri ktorom sa využije rozdiel v hustote medzi tukovým a chudým tkanivom. Tukové tkanivo cicavcov má hustotu približne 0,9 g/ml 14, zatiaľ čo kostrové svalstvo má hustotu 1,06 g/ml 15. Tento rozdiel znamená, že zvieratá s vyššími zásobami tuku majú nižšiu hustotu ako zvieratá s nižšími zásobami tuku. ktoré im umožňujú vznášať sa v roztoku s lepšou hustotou tuhých látok. Táto vlastnosť umožňuje extrémne rýchle skríning veľkého počtu zvierat, pričom je lacný aj neinvazívny. Analýza založená na vztlaku sa použila na potvrdenie fenotypov zmeny známych regulátorov hladiny tukov, ako aj na identifikáciu nových genetických a neurologických regulátorov obezity 16,17.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

1. Zbierajte vajcia z rúna so zaujímavými genotypmi

POZNÁMKA: Ideálne kríže tvoria 150 panenských mušiek a najmenej 75 mužov. Na zbierkach by malo byť minimálne 200 múch.

2. Presuňte larvy do experimentálnych potravín

  1. Pripravte experimentálne jedlo.
    POZNÁMKA: Tento recept na jedlo je založený na receptúre Middle Recept Bloomington Stock 18. Medzi dôležité zmeny patrí posudzovanie, ktoré zahŕňa zvýšenie množstva kvasiniek na optimalizáciu výživovej hodnoty jedla načasovaním fázy chôdze (medzi 112 - 120 hodinami po zbere vajec pri 25 ° C). Aj keď sme tento recept považovali za ideálny pre zdravie a vývoj našich experimentálnych lariev, receptúra ​​jedla je prijateľná pri kalibrácii s pozitívnymi a negatívnymi kontrolami, ktorých príklady sú uvedené v kroku 3.10.
    1. Odmerajte 1 600 ml destilovanej vody.
    2. Zmiešajte 134 g kukuričnej múky, 10,6 g agaru Drosophila typu II a časť vody (

    500 ml) v 1 l kadičke. Mixujte 2 minúty pomocou motorového ručného mixéra. Zmiešajte 70 g živého suchého droždia, 18,4 g sójovej múky, 84,8 g sladového extraktu a trochu vody (

    3. Stanovte hladinu tuku v larvách

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Reprezentatívne výsledky

    ilustrácia 1 ukazuje príklad toho, ako test založený na vztlaku dokáže zistiť vyššie aj nižšie zásoby tuku v larvách geneticky upravených. 1A ukazuje, že stimulácia alebo stíšenie konkrétnej podskupiny neurónov (E347) v mozgu lariev indukuje nižšie a vyššie zásoby tuku. V obidvoch prípadoch sa použila rovnaká genetická kontrola pozadia. 1B ukazuje príklad toho, ako je tento fenotyp získaný testom hustoty potvrdený extrakciou neutrálnymi lipidmi a kvantifikáciou pomocou GCMS.

    stanovenia
    ilustrácia 1. Nervová funkcia v určitých oblastiach mozgu lariev je nevyhnutná a dostatočná na the telesný tuk - nariadenia. Nervová aktivita v označenej línii E347-GAL4 bola umlčaná nadmernou expresiou Shi DN alebo aktivovaná nadmernou expresiou NB, ako je uvedené v paneloch, a boli hodnotené účinky na telesný tuk. (A) Percento lariev pláva v rovnováhe v roztokoch s rôznou hustotou. Na biologickú replikáciu sa vyšetrilo 50 lariev, n = 7 až 9 biologických replikátov na genotyp (B) Percento telesného tuku (úplne neutrálne lipidy vrátane triacylglyceridov a fosfolipidov delené telesnou hmotnosťou), merané pomocou GCMS 17,20 (n = 8). Modré čiary alebo stĺpce predstavujú zvieratá krížené iba s GAL4 (bez UAS) w 1118 kvôli účinkom genetického pozadia kontrolovať. Hodnoty P predstavujú výsledky dvojstranných t-testov. **** P 16 zmenené. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Diskusia

    Ďalšou výhodou tejto techniky oproti iným je zvýšená citlivosť na malé zmeny v hladinách tukov v populácii. Spustením celého koncentračného gradientu v populácii 50 lariev sú malé posuny v hodnotách tukov v populácii identifikované zmenou stredných koncentrácií, hoci koncentrácia lariev začína plávať a je úplná, nemusí sa líšiť od kontrol vznášal sa. Tento malý posun v populácii nemožno vždy identifikovať inými metódami kvantifikácie tukov, pretože si vyžaduje analýzu veľkej skupiny lariev. Test hustoty na druhej strane kladie otázky jednotlivcom v populácii a následne dokáže zistiť tieto malé zmeny alebo posuny v celkovom rozložení populácie.

    Pretože táto technika sa spolieha na hustotu roztoku, aby priniesla spoľahlivé výsledky, je nesmierne dôležité, aby sa roztoky PBS a sacharózy pripravovali konzistentne. Zistili sme, že rôzne recepty PBS spôsobujú rozdiely v hustote roztoku a vedú k rôznym výsledkom. Na dosiahnutie konzistentných výsledkov použijeme vyššie uvedený recept. Okrem toho je dôležitá výroba 20% sacharózy z rovnakej dávky 1x PBS, pretože vedie k hustote roztoku na rovnakom pozadí. Ak boli tieto dva roztoky pripravené samostatne, mierne zmeny hustoty v PBS by mohli spôsobiť ďalšie premenné hustoty nad rámec pridania sacharózy do experimentálnej kužeľovitej liekovky. Nakoniec môže byť problémom odparovanie, pretože v priebehu času, keď sa voda odparí, budú roztoky koncentrovanejšie. Preto je dôležité fľaše pevne uzavrieť a každý týždeň redizajnovať roztok, aby experimentálne roztoky zostali konzistentné.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.