Mitochondriálne choroby
Gerbitz, Klaus-Dieter; Gempel, Klaus; Bauer, Matthias F.
Väčšina štiepenia mastných kyselín a aminokyselín je lokalizovaná intramitochondriálne. Poruchy týchto metabolických ciest vedú k metabolickým chorobám, ktoré väčšinou postihujú novorodenca, zriedkavejšie staršie deti alebo dospelých. Poruchy enzýmov sú charakterizované zvýšenými metabolitmi, ktoré sa hromadia pred postihnutým enzýmom. Technológia tandemovej hmotnostnej spektrometrie dnes umožňuje určiť veľké množstvo týchto diagnosticky priekopníckych metabolitov z niekoľkých mikrolitrov krvi. V mnohých prípadoch to umožňuje stanoviť správnu diagnózu bez toho, aby ste sa museli uchýliť k zložitým a niekedy invazívnym metódam. Tento prehľadný článok predstavuje spôsob činnosti tandemovej hmotnostnej spektrometrie, venuje sa biochémii, patobiochémii a terapii degradácie vybraných mastných kyselín a aminokyselín a na typických príkladoch demonštruje význam novej technológie.
Kľúčové slová: tandemová hmotnostná spektrometria, vrodené metabolické poruchy, oxidácia mastných kyselín, organoacidúria, metabolizmus aminokyselín
Mitochondriálne choroby: hmotnostná spektrometria vrodených porúch metabolizmu tukov a aminokyselín
Hlavné časti metabolických dráh tukov a aminokyselín sa nachádzajú v mitochondriu. Poruchy pozdĺž týchto ciest môžu spôsobiť metabolické choroby novorodencov, kojencov alebo dospelých. Nedostatok enzýmov blokuje metabolizmus v definovaných krokoch a vedie k akumulácii špecifických substrátov. Tandemová hmotnostná spektrometria (TMS) teraz poskytuje novú a neinvazívnu metódu vhodnú na meranie akumulovaných a orientačných metabolitov vo veľmi malých vzorkách krvi. TMS umožňuje rýchle potvrdenie enzymatického defektu spôsobujúceho ochorenie, ktorý sa predtým musel identifikovať invazívnymi a rozšírenými biochemickými postupmi. Tento prehľadný článok demonštruje výhody tandemovej hmotnostnej spektrometrie v diagnostike a terapii porúch tukov a aminokyselín. Biochémia a patobiochémia týchto vrodených chýb metabolizmu a ich potvrdenie sú demonštrované typickými chorobnými prípadmi.
Kľúčové slová: Tandemová hmotnostná spektrometria, vrodené poruchy metabolizmu, oxidácia mastných kyselín, organické acidúrie, metabolizmus aminokyselín
Choroby transportného systému karnitín/acyl-karnitín
Nedostatok karnitín-palmityl transferázy: Nedostatky karnitín-palmityl transferázy (CPT) sa delia na svalový nedostatok, ktorý ovplyvňuje CPT II (®) a hlavne v ranom dospelosti (OMIM 255110), zriedka aj u novorodencov (OMIM) 600649) a menej častý infantilný hepatálny typ, pri ktorom aktivita pečene CPT I () úplne chýba (OMIM 255120). Nedostatky CPT, ktoré sa vyskytujú v detstve, sú charakterizované ťažkou hypoglykémiou a hypoketonémiou, nedostatok CPT-II u dospelých sa prejavuje cvičením vyvolanou rabdomyolýzou.
Nedostatok karnitínu
Deficit karnitínu (case) (OMIM 212138) ovplyvňuje skutočný transportný proteín, ktorý vedie k prenosu mastných kyselín z cytozolovej strany mitochondriálnej vnútornej membrány do matrice, kde prebieha skutočná beta-oxidácia. Toto ochorenie je zvyčajne klinicky náročné a vyznačuje sa neketotickou hypoglykémiou, svalovou slabosťou a väčšinou kardiomyopatiou (9).
Ako je tento článok citovaný:
Dt Дrztebl 1999; 96: A-3035-3042
[Číslo 47]
Beaudet AL, Sly WS, Valle D, ed.: Metabolické a molekulárne základy dedičného ochorenia. New York: McGraw-Hill, 1995; 1501-1533.
14. Tang NLS, Ganapathy V, Wu X a kol.: Mutácie OCTN2, transportéra organických katiónov/karnitínu, vedú k deficitu absorpcie bunkového karnitínu pri deficite primárneho karnitínu. Hum Mol Genet 1999; 8: 655-660.
15. Wilcken B, Leung KC, Hammond J, Kamath R, Leonard JV: Tehotenstvo a nedostatok 3-hydroxyacyl koenzýmu A dehydrogenázy s dlhým reťazcom u plodu. Lancet 1993; 341: 407-408.
Adresa autora
Prof. Dr. med. Klaus-Dieter Gerbitz
Ústav pre klinickú chémiu, molekulárnu diagnostiku a mitochondriálnu genetiku
Výskumná skupina pre cukrovku v nemocnici v Mníchove-Schwabingu
Kцlner Platz 1
80804 Mníchov
Transport mastných kyselín a b-oxidácia. Mastné kyseliny s dlhým reťazcom zo štiepenia triglyceridov sa po prechode plazmatickou membránou (PM) aktivujú na estery acyl-CoA. Estery CoA sa konvertujú na acyl-karnitín pomocou CPT I (pozri skratky v texte), transportujú sa cez vnútornú membránu pomocou translokázy karnitín/acyl-karnitín a pomocou CPT II sa konvertujú späť na acyl-CoA. Transportér karnitínu závislý od sodíka v plazmatickej membráne (OCTN2) sprístupňuje voľný karnitín pre tento proces. B-oxidácia mastných kyselín prebieha v mitochondriálnej matrix. Ich konečné produkty FADH2 a NADH sa oxidujú v dýchacom reťazci, zatiaľ čo acetyl-CoA sa zavádza do citrátového cyklu.
Tandemová hmotnostná spektrometria (TMS)
Hmotnostná spektrometria je známa už 30 rokov a umožňuje s vysokou presnosťou určiť hmotnosti ionizovaných molekúl (5). Identifikácia je založená na skutočnosti, že ióny rôznych hmotností sú v elektromagnetickom poli vychýlené do rôznych stupňov. Rozhodujúce technické zlepšenia za posledných pár rokov prispeli k tomu, že sa hmotnostná spektrometria stala dôležitou metódou v metabolickom laboratóriu:
- zavedenie metód „mäkkej“ ionizácie, ako je metóda elektrospreja
- vývoj výkonných hmotnostných analyzátorov (štvorpólov)
- sériové pripojenie dvoch analytických štvorpólov („tandemový“ MS)
Štruktúra tandemového hmotnostného spektrometra:
Hmotnostný spektrometer pozostáva z iónového zdroja, v ktorom je zo vzorky generovaný lúč plynných iónov, z hmotnostného analyzátora, ktorý oddeľuje ióny podľa ich kvocientu hmotnosť/náboj, a z detektora, ktorý dodáva hmotnostné spektrum s relatívnymi intenzitami jednotlivých iónov (graficky 6). Na ionizáciu sa vzorka postrieka jemnou ihlou, na ktorú sa aplikuje vysoké napätie (elektrosprejová ionizácia). Hromadná analýza iónov sa uskutočňuje v takzvaných štvorpóloch. V tandemovom hmotnostnom spektrometri sú za sebou pripevnené dva štvorpóly (Q1 a Q2). Kolízna bunka sa nachádza medzi Q1 a Q2, v ktorej sú ióny fragmentované v závislosti od ich molekulárnej štruktúry. Toto usporiadanie umožňuje identifikáciu špecifických metabolitov na základe hmotnosti intaktnej molekuly a charakteristického fragmentu. Výhodou tohto tandemového princípu oproti starším jednoduchým spektrometrom je, že spektrá metabolitov je možné určiť z komplexnej matrice, ako je sérum, bez predchádzajúcej chromatografickej separácie.
Poruchy metabolických ciest mitochondriálnych aminokyselín. Štiepenie aminokyselín s rozvetveným reťazcom, leucínu, izoleucínu a valínu, ako aj lyzínu a tryptofánu prebieha z väčšej časti v mitochondriálnej matrici. Konečné produkty sa buď zavádzajú do citrátového cyklu (acetyl-CoA a sukcinyl-CoA), alebo sa používajú ako ketónové látky (acetoacetát) na dodanie energie. Redukčné ekvivalenty FADH2 a NADH sa používajú v dýchacom reťazci na výrobu energie, rovnako ako pri oxidácii mastných kyselín.
Nedostatok MCAD. Je ukázané normálne karnitínové spektrum, ktoré pokrýva rozsah od voľného karnitínu (m/z = 218) do C18 karnitínesteru (m/z = 484; m/z = hmotnosť/náboj, z = 1). Na úsečke je uvedená hmotnosť intaktného esteru karnitínu, na súradnici intenzita iónov. Normálne karnitínové spektrum pozostáva z približne 70% voľného karnitínu (218), takzvané acylkarnitíny v podstate pozostávajú z acetylkarnitínu (260). Pri nedostatku MCAD dochádza k zníženému odbúravaniu mastných kyselín C6-C10. V karnitínovom spektre novorodenca preto zvyčajne dochádza k zvýšeniu C6-karnitínu (316), C8-karnitínu (344) a tiež C10: 1-karnitínu (370); Táto mononenasýtená mastná kyselina je produkovaná štyrmi b-oxidačnými cyklami C18: 1, kyseliny olejovej, bežnejšej mastnej kyseliny v potrave; tieto štyri cykly sú katalyzované VLCAD.
Kyselina propiónová a kyselina metylmalonová. V propiónovej acidúrii sa okrem voľného a acetylkarnitínu vyskytuje aj propionylkarnitín (274), ktorý sa inak vyskytuje iba stopovo. Karnitínové spektrum štvorročného dieťaťa s metylmalonovou acidúriou, ktoré už má diétu s nízkym obsahom izoleucínu a valínu a ktoré je doplnené karnitínom, tiež ukazuje metylmalonyl-karnitín (374). Voľný karnitín sa zvyšuje vďaka liečbe karnitínom.
Deficit HMG-CoA lyázy a glutarová acidúria typu I. Šesťročné dieťa so známym nedostatkom HMG-CoA lyázy, ktoré už bolo liečené špeciálnou diétou s nízkym obsahom amínov a karnitínom, bolo vyšetrené v intervale bez príznakov. Nevybavené zásoby pred metabolickým blokom sa prejavujú v sére špecifickým zvýšením 3-hydroxyizovalerylkarnitínu (318) a 3-metylglutarylkarnitínu (402). Glutaryl-CoA produkovaný štiepením lyzínu a tryptofánu sa nachádza v GA I ako glutaryl-karnitín (388). Iné nápadné vrcholy v rozmedzí mastných kyselín s krátkym, stredným a dlhým reťazcom nie je možné zistiť, čo vylučuje GA typu II.
Schematické znázornenie tandemového hmotnostného spektrometra s elektrosprejom