Model aterosklerotického plaku ľudského ex Vivo na štúdium protokolu biologickej lézie (preložený do nemčiny)

Zhrnutie

Ateroskleróza je chronický zápalový proces. Tento rukopis ilustruje ľahko použiteľný model ex vivo na vyšetrenie čerstvých karotických alebo koronárnych srdcových plakov. Model ex vivo umožňuje skúmanie možných látok v zápalovom prostredí v ľudských arteriosklerotických léziách a výsledky je možné skúmať rôznymi metódami.

vivo

Abstrakt

Úvod

Ateroskleróza ako chronické zápalové ochorenie je jednou z hlavných príčin smrti v priemyselných krajinách 1/2. Komplikácie aterosklerózy, najmä akútny koronárny syndróm, súvisia s prasknutím citlivých lézií, čo vedie k aterotrombóze a vaskulárnej oklúzii. 3. Zdá sa, že vrodená a získaná imunita je súčasťou všetkých krokov aterogenézy 2,4-5. Aj keď sa v liečbe srdcového infarktu dosiahol značný pokrok, účinná prevencia aterosklerózy a kardiovaskulárnych vedľajších účinkov stále nie je vyriešená. Štúdium biológie lézií je teda dôležité pre rozšírenie našich znalostí o patofyziológii aterosklerózy a pre identifikáciu nových terapeutických cieľov a vývoj nových terapií.

V mnohých prípadoch sa myšie modely používajú na štúdium patofyziológie konkrétnych chorôb. Štúdium aterogenézy na myšacích modeloch je však sprevádzané niekoľkými obmedzeniami: (1) Aterosklerotické myši majú obvykle diétu s vysokým obsahom cholesterolu. Hladiny cholesterolu v týchto modeloch nemožno porovnávať s hladinami pacientov so zvýšenou hladinou cholesterolu v sére 6. (2) Existujú významné rozdiely medzi myším a ľudským imunitným systémom; teda Foxp3 je špecifickým markerom pre myšacie regulačné T bunky, zatiaľ čo expresia ľudského Foxp3 v ľudských T bunkách nevyhnutne neprináša regulačný fenotyp 7. Rovnako paradigma Th1/Th2 ako u ľudí nie je definovaná pre myšacie T bunky. Plne prenosné bunky. (3) Sada markerov, ktoré sa používajú na identifikáciu myších monocytov a makrofágov, ako napríklad F4/80 a markery klasických (M1) verzus alternatívnych (M2) aktivačných vzorcov, ktoré nie sú prítomné v ľudských myeloidných bunkách. (4) Génová expresia myších a ľudských monocytov v periférnej krvi sa ukázala ako nevyhnutná 9.

Aby sme teda lepšie porozumeli chronickým zápalovým procesom pri ľudskej ateroskleróze, musíme využiť modely práce s ľudským tkanivom, krvou alebo bunkami. Tu popisujeme model tkanivovej kultúry ľudských plakov, ktorý umožňuje skúmať možné nové látky v koncepcii biológie zápalových lézií človeka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

1. Pripravte médium nasledujúcim spôsobom

  1. Kultivačné médium: RPMI médium.
  2. Staňte sa 10% fetálnym teľacím sérom (FCS).
  3. So 100 U/ml penicilínu G a 100 g/ml streptomycínu.

2. Až do použitia uchovávajte čerstvé valce s plakmi

  1. Karotickú endarterektómiu operujú pacienti s ischemickými príznakmi alebo bez nich (mŕtvica, prechodný ischemický záchvat) s významnou stenózou karotídy cievnymi chirurgmi a koronárnou srdcovou endarterektómiou počas operácií koronárneho bypassu srdcovými chirurgmi. Karotické/koronárne plaky sa musia odstrániť en bloc, aby sa zachovala štruktúra plakov, ako je opísané vyššie. 5.
  2. Po odstránení plaku vložte vzorku do stredne naplnenej skúmavky a až do použitia ju uložte na ľad (plak musí byť úplne pokrytý médiom).

4. Po stanovenom čase odberu kúskov tkaniva plaku

  1. Šokové zmrazenie kúskov plaku na izoláciu mRNA a syntézu cDNA (podrobné informácie nájdete v časti 5 protokolu protocol).
  2. Supernatant a uskladnený pri -20 ° C pre analýzu ELISA.
  3. Pri Western blote rozbite a lýzujte tkanivo plaku. Lyzát sa filtruje cez zariadenie s odstredivým filtrom 0,65 um a 0,1 um.
  4. Vložte plakové tkanivo do tkaniva-tec alebo parafínu na imunohistochemické farbenie.

5. Extrakcia RNA z kultivovaných kúskov plaku

  1. Na homogenizáciu použite TissueLyser.
  2. Izolujte RNA pomocou súpravy (pozri tabuľku materiálov) podľa pokynov výrobcu.
  3. Stanovte množstvo a kvalitu RNA vo vzorkách pomocou spektrofotometra.
  4. Použite súpravu Boehringer cDNA na reverznú transkripciu podľa pokynov výrobcu.
  5. Na kvantitatívnu PCR použite napríklad súpravu Roche real-time PCR so SYBR Green.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Najprv ukážeme časovo závislé zmeny zápalovej zlúčeniny nestimulovaných kultivovaných aterosklerotických lézií kvantitatívnou polymerázovou reťazovou reakciou v reálnom čase (qRT-PCR). (Obrázok 1) analyzované. Počas kultivácie plakov je možné pozorovať zvýšenie aktivity zápalového lézie. Nezistil sa žiadny rozdiel po 3 hodinách oproti kultúre (údaje nie sú uvedené). Po 8 hodinách kultivácie plakov sme zistili iba miernu zvýšenú reguláciu niektorých molekúl, ako je IL-6, ale nie TNF-a a IFN-g, zatiaľ čo po 24 hodinách došlo k zvýšenej regulácii rôznych molekúl, ako sú TNF a, IL-6 a IFN- G. Je pozoruhodné, že čím dlhší čas je kultivácia plaku, tým vyššia je variácia v molekulárnej expresii.

Po druhé, aby sme demonštrovali uskutočniteľnosť ovplyvnenia zápalového prostredia v aterosklerotických léziách, uvádzame výsledky kúskov plakov s 1 ug/ml LPS po dobu 3 hodín, merané pomocou qRT-PCR (Obrázok 2) inkubované. Nestimulované kúsky plaku slúžili ako negatívne kontroly. Zistili sme, že LPS indukoval výrazné zvýšenie stupňa aktivácie zápalovej zlúčeniny v aterosklerotických léziách. Rôzne cytokíny (IL-6, TNF-a atď.)., Obr. 2A-B), Chemokíny (CCL2 atď., Nezobrazené), adhézia (ICAM-1, nezobrazené), destabilizujúce plaky (matricová metalopeptidáza 9 (MMP9), nezobrazené) a protrombotické molekuly (von Willebrandov faktor), 2C, Tkanivový faktor (nie je uvedený) bol regulovaný LPS inkubáciou.

Po tretie, na vyhodnotenie množstva proteínu sa pomocou ELISA analyzovali úrovne kultivovaných lézií a tkanivá plaku sa narušili Western blotom. (Obrázok 3D). V Obrázky 3A-C ukazujeme ELISA analýzu IFN-g, MCP-1 a TNF-a v supernatante kultivovaných vzoriek inkubovaných s LPS alebo kontrolou po dobu 8 hodín. Okrem Western blot analýzy (fosforylovanej) sa ERK 1/2 rozbila a tkanivo plaku sa lyžovalo, buď LPS-stimulovanou kontrolou a v Obrázok 3D zobrazené.

Diskusia

Tu uvádzame model kultivácie plakov ex vivo na skúmanie vplyvu potenciálne relevantných látok na biológiu aterosklerotických lézií. Hlavnou výhodou týchto metód ex vivo je možnosť posúdiť vplyv uvedených látok na zápalové bunky a ich interakcie medzi bunkovými a zápalovými cestami a kaskádami v ľudských aterosklerotických léziách. Niekoľko užitočných metód (napr. RT-PCR, Western blot, imunohistochémia, prietoková cytometria, ELISA) pomáha vytvoriť komplexnú analýzu účinkov sledovanej látky na zápal aterosklerotických lézií.

Zápalové procesy pri myšej ateroskleróze sú dobre známe, a to aj vďaka myšacím modelom nadmernej expresie alebo nedostatku určitých záujmových génov 11. Výsledky však nie vždy zodpovedajú ľuďom 6-9,13. Aterosklerotické myši zvyčajne dostávajú vysoko patologickú cholEsterolovú stravu 6. Okrem toho je známe, že imunitný systém medzi ľuďmi a myšami vykazuje významné rozdiely 9.7. Tu uvádzame model kultivácie plakov ex vivo, ktorý umožňuje študovať vplyv sledovanej látky na inhibičnú zlúčeninu v ľudských aterosklerotických léziách, ako popisuje Niessner et al. 14 zobrazené. Okrem toho je možné na analýzu výsledkov experimentu s kultiváciou plakov porovnateľných s myšacími štúdiami použiť rôzne ďalšie metódy. Preto model ex vivo otvára v niektorých prípadoch možnosť nahradiť myšacie štúdie in vivo a môže predstavovať vynikajúci spôsob premostenia predpokladanej molekuly podporujúcej aterosklerózu v myšom systéme a translácie v ľudskej biológii.

Ľudský model aterosklerózy ex vivo nie je porovnateľný s experimentmi na bunkách in vitro. Bunkové línie je možné ľahko skladovať a kultivovať, ale nie sú fenotypicky a funkčne identické s primárnymi bunkami. Čerstvé bunky možno získať pravidelným odberom krvi, ale niekedy je ťažké ich kultivovať a kultúra podlieha mnohým faktorom. Ďalej pomocou experimentov s bunkovými kultúrami in vitro nie je možné študovať vplyv špecifických molekúl na inhibičnú zlúčeninu v aterosklerotických léziách. In vitro experimenty sú teda dôležité pre počiatočný (translačný) krok v oblasti humánnych biologických výskumov, ale nie pre ďalšiu analýzu úlohy sledovanej molekuly v koncepcii ľudskej aterosklerózy, najmä bunkovej súhry a vplyvu na zápalové kaskády a cesty v tele. aterosklerotické lézie .

Monaco a kol. Zaviedol dôležitý krátkodobý kultivačný systém buniek izolovaných z ľudského aterosklerotického tkaniva15. Použili ste enzymatickú zmes kolagenázy, elastázy a DNázy. Táto metóda umožňuje skúmanie experimentov lézií bunka-bunka, analýzu signálnej dráhy a štúdie génového prenosu s adenovírusovými vektormi. Zostáva však neznáme, ako enzymatická zmes ovplyvňuje bunky, t.j. stupeň aktivácie, expresia povrchových markerov atď. Ďalej je otázne, či výsledky týchto experimentov odrážajú skutočné procesy v aterosklerotických léziách. Okrem toho bude pôvodná poloha buniek zničená enzymatickým zmiešaním a krátkodobý kultivačný systém má rovnaké obmedzenia ako pri bunkových experimentoch in vitro.

Pre špecifické štúdie buniek alebo bunkovej populácie v rámci aterosklerotickej lézie je možné použiť metódu mikrodisekcie laserovým zachytením. Požadovaná bunka alebo bunková zlúčenina bude vyrezaná z tkaniva pomocou infračerveného alebo UV lasera a môže byť vykonaná analýza RNA, DNA alebo proteínu. Zdá sa, že mikrodisekcia laserovým zachytením nepoškodzuje bunky, expresiu receptora na bunkovom povrchu atď. Výhodou metódy je analýza bunky alebo miesta záujmu v aterosklerotickej lézii. Ale nie je možné ďalej hodnotiť bunky ako in vitro štúdie.

Model ex vivo je založený na vzorkách endarterektómie. Použitie aterosklerotických plakov získaných od rôznych jedincov môže viesť k vyššiemu stupňu rozdielneho zloženia buniek, a teda k väčšej variácii hladín požadovaných génov/proteínov. Preto je dôležité použiť nefibrosklerotické lézie 10 vzoriek plakov bohatých na lipidy alebo komplikovaných plakov, pretože zápalová odpoveď je vo fibrosklerotických léziách výrazne nižšia. Preto je veľkým záujmom hodnotiť morfológiu plakov pred analýzou výsledkov experimentov s kultiváciou plakov.

Okrem toho každá vzorka obsahuje rôzne stupne vývoja/progresie aterosklerotických lézií od počiatočnej endotelovej dysfunkcie a akumulácie lipidov po tukové pruhy a vývoj nekrotického jadra až po prasknutie plakov. Preto, aby sa minimalizovala heterogenita tkanív plaku, je potrebné znížiť okraje, ktoré obvykle predstavujú počiatočné kroky v aterogenéze.

Nemožno vylúčiť, že rezanie vyvolalo reakcie poranenia tkaniva. Ale naše experimenty s tkanivovou kultiváciou plakov ukázali porovnateľnú génovú expresiu kultivovaného tkanivového plaku s nekultivovaným tkanivovým plakom. To teda zdôrazňuje, že súčasná metóda je dobrým nástrojom na štúdium zápalového prostredia v aterosklerotických léziách.

Kusy KulturPlaque sú obmedzené na obdobie až jedného dňa. Ak sa tkanivo plaku kultivuje dlhšie ako jeden deň, rozdiely vo výsledkoch sa dramaticky zvyšujú. Navyše, po 3 dňoch sa zloženie plaku a morfológia zrútia.

Pri uplatňovaní tohto modelu je potrebné pamätať na určité limity. Ex vivo model je dobrou metódou na štúdium zápalového prostredia v aterosklerotických léziách. V tejto súvislosti stále chýbajú dôležité komponenty. Nie sú použiteľné žiadne hemodynamické vlastnosti a systémové vplyvy úplne chýbajú. Ďalej je pomocou tejto metódy možné študovať iba krátkodobé zmeny, ale chýba jej dlhodobá analýza z dôvodu kolapsu morfológie plakov.

Na záver tu uvádzame metódu, ktorá bude užitočná pre vedcov, ktorí hľadajú štúdium potenciálnych nových molekúl zápalu ľudských aterosklerotických lézií. Model kultivácie plakov ex vivo netrpí rozdielmi medzi myšacím a ľudským imunitným systémom, ale dáva nám príležitosť analyzovať bunkovú interakciu v kontexte aterosklerotických lézií a poskytuje príležitosť skúmať lokálne zápalové kaskády a cesty lézií. Tu popísaná metóda kultivácie plakov ex vivo je ľahko použiteľná a je reprodukovateľná a môže pomôcť identifikovať a overiť nové mechanizmy ochorenia a terapeutické ciele.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Zverejnenie

Autori nemusia zverejňovať žiadne konflikty.