Myšací model slepého čreva s chronickou kolitídou spojený s kolorektálnym karcinómom presnou lokalizáciou

Zhrnutie

Predložený protokol popisuje jednoduché chirurgické odstránenie slepého čreva (slepého čreva) u myši, po ktorom nasleduje indukcia rakoviny hrubého čreva spojená so zápalovým ochorením čriev. Tento model myšej apendektómie umožňuje skúmanie biologickej úlohy slepého čreva v patogenéze ľudského gastrointestinálneho ochorenia.

Abstrakt

Úvod

Klinická apendektómia je štandardný chirurgický zákrok s odstránením slepého čreva hlavne kvôli zápalu (napr. Apendicitída) 1, 2, 3. Biologická funkcia červovitého ľudského apendixu však zostáva kontroverzná 4, 5, 6. Slepé črevo sa považovalo za pozostatok zvyškov premietnutý z céka v hrubom čreve. Až donedávna evolučné, imunologické, morfologické a mikrobiologické štúdie naznačovali, že slepé črevo môže mať rôzne funkcie. Medzi tieto úlohy patrí produkcia imunoglobínov (napr. IgA a IgG), rôznych B-buniek a T-buniek, ktoré sú rozhodujúce pre adaptívne imunitné reakcie v črevách spojených lymfatických tkanív (GALT), a doplnenie hrubého čreva. s komenzálnou mikroflórou. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 .

Klinické epidemiologické štúdie pacientov s predchádzajúcou apendektómiou alebo akútnou apendicitídou majú tiež svoju potenciálnu úlohu v patogenéze ľudských chorôb, ako sú zápalové ochorenia čriev (IBD), rakovina hrubého čreva a gastrointestinálne ochorenia (napr. Parkinsonova a kardiovaskulárna choroba) 13, 14, 15, 16, 17, 18. Napríklad veľká kohortná štúdia ázijskej populácie so 75 979 pacientmi s apendektómiou nedávno preukázala významnú súvislosť medzi rakovinou slepého čreva a mierou úmrtnosti 14, 19. Preto vytvorenie vhodného zvieracieho modelu slepého čreva, ktorý sa podobá človeku, pomôže pri štúdiu biologických funkcií a molekulárnych mechanizmov slepého čreva v patogenéze choroby.

Mnoho cicavcov má slepé črevo alebo orgán podobný slepému črevu, vrátane primátov, zajacovitých (napr. Králikov), niektorých hlodavcov a vačnatcov 20. U malých a často používaných laboratórnych zvierat má králik vermiformný apendix, ktorý je podobný ako u ľudí 21, 22, ale GALT u králikov je v porovnaní s ľuďmi extrémne veľký, pretože väčšina lymfatických tkanív sa nachádza aj v Peyerových náplastiach, ktoré sú oba tenké - rovnako ako v hrubom čreve 21. Okrem toho králik vykazuje odlišnú lymfoidnú folikulárnu štruktúru, distribúciu T-buniek a hustotu imunoglobulínov od ľudí, takže ich doplnky nie sú vhodné pre štúdiu 21. .

Myši sú najbežnejšie používaným zvieracím modelom na štúdium ľudskej patofyziológie a na testovanie rôznych existujúcich a nových terapeutík 23, 24, 25. Predpokladá sa, že jediný biely veľký lymfoidný zhluk na konci slepého čreva u myší, známy ako céková náplasť, plní funkcie podobné tým, ktoré sú uvedené v ľudskom dodatku 26, 27, 28. Je však prakticky ťažké oddeliť slepú náplasť od slepého čreva u myší. Zvyčajné chirurgické zákroky na vyvolanie apendicitídy na myšom modeli doteraz zahŕňali pomerne veľký rez (napr. 1 - 2 cm) cez brušnú stenu, aby sa získal prístup k celému slepému črevu (Dodatková tabuľka 1) 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 .

V tomto dokumente predstavuje generovanie modelu slepého čreva súvisiaceho s gastrointestinálnym ochorením ľahký chirurgický protokol na odstránenie slepého čreva u myší. Nasleduje kombinované podávanie genotoxického činidla AOM a prozápalového činidla DSS na vyvolanie rakoviny hrubého čreva spojenej s kolitídou podobné ako u ľudí. Ukázalo sa, že IBD je rizikovým faktorom pre rakovinu hrubého čreva 37, 38. Kombinácia AOM/DSS-indukovanej chronickej kolitídy spojenej s rakovinou hrubého čreva je dobre zavedená a čitatelia sa môžu odvolať na Neufert et al. a Thaker a kol. podrobné postupy pozri v bodoch 39, 40. Tento reprodukovateľný a rýchly model slepého čreva je možné použiť na štúdium črevného zápalu a mikrobioty modulovaného slepým črevom, najmä pri vývoji a progresii IBD a rakoviny hrubého čreva.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Všetky postupy na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat na Univerzite Xi'an Jiaotong (č. XJTULAC2019-1023).

2. Indukcia rakoviny hrubého čreva spojenej s chronickou kolitídou pomocou AOM a DSS

POZNÁMKA: Tento postup vykonajte 7 dní po operácii slepého čreva.

3. Vyhodnotenie črevného zápalu a nádoru (70 dní po podaní AOM)

  1. Obetujte myši inhalovaním CO2 pri miere naplnenia 10% v komore eutanázie, po ktorej nasleduje dislokácia krčka maternice.
  2. Zoberte celé hrubé črevo od hornej časti ileo-kolikového spojenia po konečník.
  3. Lumenovú stranu odkryte pozdĺžnym otvorením hrubého čreva. Nakrájajte celé hrubé črevo na 10 cm dlhé kúsky a zafixujte tkanivo hrubého čreva v 10% formalíne po dobu 72 hodín, aby sa farbilo hematoxylínom a eozínom (H&E).

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Vytvorenie modelu myšej apendektómie

Tento model myšej apendektómie rakoviny hrubého čreva spojeného s kolitídou je možné vytvoriť postupnými chirurgickými a indukčnými krokmi, ako je znázornené na obrázku 1.zobrazené. Najbežnejšie polohy slepého čreva sú v ľavej a pravej iliačnej fosse, za ktorou nasleduje stredná čiara brucha (obrázok 2).). Úspešnosť predbežnej lokalizácie slepého čreva pred brušným rezom pomocou palpačnej metódy je takmer 70% (Ďalšie informácie, tabuľka S2). Procedúry slepého čreva v zásade zahŕňajú šesť dôležitých krokov (obrázok 3). Počas apendektómie je pre minimalizáciu chirurgického traumy rozhodujúci stredový rez v dĺžke až 0,5–1,0 cm (obrázok 3)A.). V prípade intraperitoneálneho úniku je potrebné ligovať mezangiálne cievy a uzavrieť pahýľ slepého čreva, namiesto jednoduchého podviazania bežať stehy (obrázok 3)B, C, D, E).

Vyhodnotenie IgA ako biomarkeru u myší s apendektómiou

Na potvrdenie mykotómie slepého čreva sa po operácii odobralo hrubé črevo myší a fekálny obsah na stanovenie koncentrácií IgA-špecifických plazmatických buniek a sekrečných koncentrácií IgA (sIgA). Myši po slepom čreve vykazovali významné zníženie percenta plazmatických buniek špecifických pre B220-IgA + v porovnaní s fingovanou skupinou (obrázok 4)ZO). Falošné myši si navyše udržali fekálnu koncentráciu SIgA 14 dní po operácii v porovnaní s vlastným počiatočným stavom pred operáciou, zatiaľ čo skupina s apendektómiou preukázala významné zníženie SLgA na 14. deň (obrázok 4)C.).

Validácia rakoviny hrubého čreva spojenej s kolitídou u myší slepého čreva

V porovnaní s 3% DSS, u ktorého väčšina myší v skupine s apendektómiou vykazovala ťažké komplikácie a výrazný úbytok hmotnosti (obrázok 5)A.), 2% DSS v kombinácii s AOM poskytli 80% prežitia v skupinách s fingovanou aj s apendektómiou, adekvátne zmeny telesnej hmotnosti (obrázok 5)E.). Na konci troch liečebných cyklov sa hrubé črevo odobralo na patologické hodnotenie. Vizuálna kontrola a farbenie H&E ukázali nádory hrubého čreva so zápalom hrubého čreva a rôznymi stupňami adenokarcinómov (dobre, stredne a slabo diferencované adenokarcinómy) u myší liečených 2% AOM/DSS (obrázok 6)).

model
Obrázok 1: Schematické znázornenie vytvorenia modelu myšej apendektómie rakoviny hrubého čreva spojeného s kolitídou.
(A.) Vývojový diagram hlavných chirurgických krokov (prvé tri sú kritické) v chirurgii slepého čreva. (B.Indukcia rakoviny hrubého čreva. Sedem dní po operácii slepého čreva sa AOM a DSS podávali súčasne. Hmotnosti myší sa zaznamenávali v rôznych časoch (červený trojuholník). Na 70. deň po chirurgickom zákroku boli myši utratené a bolo odobraté črevné tkanivo na ďalšie štúdium. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

model
Obrázok 2: Predbežné stanovenie polohy zápalu slepého čreva u myší pred brušným rezom.
(A.) Zhrnutie pravdepodobnosti nájdenia polohy slepého čreva. Anatomické snímky troch najbežnejších polôh slepého čreva na (B.) vpravo dole, (C.) Stredná a (D.) ľavé dolné bruško myši. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

myšací
Obrázok 3: Kritické kroky v myšej apendixektómii.
(A.) Malý rez, usporiadaný 0,5 - 1,0 cm; (B.) Po vytvorení slepého čreva vytiahnite presnú časť cekálnej náplasti. (C.) Podviazanie mezenterických ciev sprevádzajúcich slepé črevo. (D.) Označenie oblasti rezu slepého čreva stehom 4-0. (E.) Zatvorte pahýľ bežiacimi stehmi stehom 8-0. (F.) Uzavretie svalovej vrstvy prerušenými stehmi stehom 8-0. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

slepého
Obrázok 4: Kvantifikácia plazmatických buniek špecifických pre IgA a koncentrácia fekálneho SIgA po apendektómii.
(A.) Reprezentatívne bodové grafy pre bunky zafarbené anti-IgA a B220 v hrubom čreve fingovaných a slepého čreva myší 1 deň a 14 dní po operácii. Lymfocyty v lamina propria boli čerstvo pripravené a zafarbené pomocou FITC anti-myšieho IgA, PE anti-myšieho CD45R/B220 pre prietokovú cytometriu. Čísla v grafoch označujú percentuálne zastúpenie buniek v ich príslušných oblastiach. (B.) Kvantitatívne stanovenie plazmatických buniek špecifických pre IgA v fingovaných a apendektomických skupinách. Údaje predstavujú strednú hodnotu sD; n = 5-8 myší; * p Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Myší model slepého čreva spojený s kolitídou spojený s rakovinou hrubého čreva sa získal pomocou chirurgických krokov s vysokou mierou prežitia u myší. Vo väčšine prípadov bolo ťažké predvídať jeho polohu bez laparotómie, pretože slepé črevo bolo umiestnené pod brušnou stenou.(Dodatková tabuľka 1, doplnková tabuľka 2a Obrázok 2), pretože bez laparotómie bolo ťažké predvídať jeho polohu. V tomto chirurgickom protokole bol zavedený jednoduchý krok k dotyku hrče a kvantitatívne hodnotenie umiestnenia slepého čreva bolo tiež poskytnuté ako pomôcka na zvýšenie presnosti predbežnej lokalizácie slepého čreva (obrázok 2)). Použitie anatomických prvkov na odstránenie zápalu slepého čreva minimalizovalo narušenie neúmyselných častí čreva, čím sa znížila miera možných komplikácií apendicitídy a infekcie brušnej dutiny.

Tento model obsahuje tri dôležité kroky. Po prvé, vizuálne vyšetrenie a palpácia pred laparotómiou môžu byť užitočné pri určovaní celkového umiestnenia slepého čreva. Napriek tomu, že slepé črevo je s najväčšou pravdepodobnosťou v ľavej iliakálnej oblasti brucha, cekálna náplasť vyčnievajúca z hrotu slepého čreva je často disociačná (tj. Pohyblivá alebo uhniezdená) a je pravdepodobnejšie, že sa nachádza pod stredným pobrušnicou. (Obrázok 2). Po druhé, dáva sa prednosť malému rezu na stredovej čiare brucha a presnému vystaveniu ceekálnej náplasti. Je to tak preto, lebo na strednej čiare brucha je tenký bod, kde rezanie do tejto polohy môže znížiť možné poranenie vrstvy brušného svalu. Aby sa zabránilo volvulu pri apendicitíde, ktorý je škodlivý pre myši, presná expozícia slepého čreva minimalizuje náhodné narušenie čreva a znižuje riziko výskytu volvulu. Okrem toho minimálne vystavenie brušnej dutine môže zabezpečiť, aby črevá zostali nezaťažené, teplé a vlhké; Inak môže nadmerná expozícia viesť k značným stratám tepla a vysušeniu tkanív41 .

Po tretie, je potrebné vydezinfikovať a uzavrieť cékový pahýľ bežiacimi stehmi namiesto jednoduchej ligácie, aby sa zabránilo možnému krvácaniu a dezinfekcii obsahu céka v pni. Hladiny plazmatických buniek špecifických pre IgA a výkalov v hrubom čreve myší sú významne znížené slepým črevom, čo naznačuje, že prinajmenšom v počiatočnej fáze 33 je hlavnou oblasťou pre produkciu IgA céková náplasť. V hrubom čreve pôsobí sIgA ako obranca zdravia sliznice stabilizáciou normálnej kolonizácie rastlinnej flóry a pôsobením proti patogénnym mikróbom 42. Odstránenie slepého čreva znižuje produkciu IgA a môže narušiť ostázu sliznice.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.