Ortotopický model rakoviny endometria s retroperitoneálnou lymfadenopatiou vyrobený in vivo
Zhrnutie
Tento protokol poskytuje štandardizovanú metódu na pestovanie buniek VX2 v kultúre a vytvorenie ortotopického modelu VX2 rakoviny endometria s retroperitoneálnymi metastázami do lymfatických uzlín u králikov. Modely ortotopického karcinómu endometria sú dôležité pre predklinické skúmanie nových zobrazovacích metód na diagnostiku metastáz v lymfatických uzlinách.
Abstrakt
Rakovina endometria je najčastejšou gynekologickou malignitou v Severnej Amerike a jej výskyt rastie na celom svete. Liečba spočíva v chirurgickom zákroku s adjuvantnou terapiou alebo bez nej v závislosti od postihnutia lymfatických uzlín, ako je určené lymfadenektómiou. Lymfadenektómia je morbídny zákrok, ktorý nemá pre mnohých pacientov žiadny terapeutický prínos, a preto je potrebný nový spôsob diagnostiky metastáz v lymfatických uzlinách. Na testovanie nových zobrazovacích látok je potrebný spoľahlivý model rakoviny endometria s retroperitoneálnymi metastázami do lymfatických uzlín. Model karcinómu endometria VX2 bol široko opísaný v literatúre; Existujú však značné rozdiely v spôsobe nastavenia modelu. Okrem toho neboli publikované žiadne štúdie o použití kultivovaných buniek VX2 na vytvorenie tohto modelu, pretože sa doteraz používali iba bunky propagované in vivo. Predstavujeme štandardizovanú chirurgickú metódu a pooperačnú monitorovaciu metódu na stanovenie modelu rakoviny endometria VX2 a informujeme o prvom použití kultivovaných buniek VX2 na vytvorenie tohto modelu.
Úvod
Niekoľko skupín uviedlo použitie VX2 na modelovanie rakoviny endometria s retroperitoneálnymi metastázami s vysokou zaznamenanou mierou úspešnosti 36, 51, 52; V súčasnej literatúre však existujú značné rozdiely v metóde budovania modelu. Boli hlásené dávky bunkovej suspenzie tak nízke ako 4 x 105 buniek/maternicový roh 51 a až 5 x 109 buniek/maternicový roh 37, 53 bez štandardného konsenzu o požadovanej dávke buniek VX2. Boli tiež opísané rôzne vakcinačné metódy vrátane mikrochirurgickej implantácie nádorov do maternicového myometria 36, injekcie bunkovej suspenzie VX2 37, 44, 52, 53 a v niektorých prípadoch aj pridania stehov maternicového rohu pred inokuláciou 52. Napokon žiadne skupiny neuviedli použitie kultivovaných buniek VX2 na vytvorenie tohto modelu. Účelom tejto štúdie je teda preukázať úspešnú štandardizovanú metódu modelovania VX2 a uviesť prvé použitie kultivovaných buniek VX2 na modelovanie rakoviny endometria s retroperitoneálnymi metastázami u králika.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
Oklúzia hlbokej brušnej steny: Identifikujte špičku peritoneálneho rezu a tkanivovými kliešťami uchopte pobrušnicu, priamy sval a fascie. Všetky štúdie na zvieratách sa uskutočňovali v zariadeniach University Health Network schválených Animal Resource Center (ARC) a v súlade so schválenými protokolmi o použití a starostlivosti o zvieratá (AUP # 3994/# 4299). Bunková línia VX2 bola odvodená od Dr. Vyhralo Akenovo laboratórium na University Health Network.
1. Konštrukcia bunkovej línie VX2 in vitro
2. Bunková kultúra VX2 a tvorba bunkovej suspenzie
3. Nastavenie chirurgického modelu
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Pomocou nového zobrazovacieho prostriedku, Porphyso, bolo intraoperačne identifikovaných 81 lymfatických uzlín a chirurgicky odstránených na histologickú analýzu. 74 lymfatických uzlín boli ľavé panvové lymfatické uzliny, 5 boli pravé panvové lymfatické uzliny a 2 boli pravé para-aortálne lymfatické uzliny. Lymfatické uzliny odstránené z králikov s in vivo rozmnoženými nádormi VX2 boli významne väčšie a nekrotickejšie ako tie, ktoré boli odstránené z králikov s kultivovanými nádormi VX2 s priemerným objemom 0,99 cm3 (rozsah 0,12 - 3,89) ) v porovnaní s 0,59 cm3 (0,01 - 2,92) (p = 0,037). Králiky s nádormi množenými in vivo mali tiež väčšie nekrotické nádory maternice ako králiky s nádormi z kultivovaných buniek s priemernou dĺžkou 5,6 cm (4 - 6,8 cm) a priemernou šírkou 5,2 cm (3,3 - 9 cm) oproti 3,6 cm (2-5 cm) alebo 4,56 cm (3-7 cm). Napokon králičie modely z buniek VX2 množené in vivo mali viac mimododových brušných metastáz ako králičie modely z kultivovaných buniek s 91% všetkých metastáz nájdených u králikov množených in vivo.
| Typ modelu | In vivo model nádoru VX2 | Kultivovaný model nádoru VX2 |
| Počet úspešných modelov | 16 | 5 |
| Počet vyskúšaných modelov | 22 * | 8. |
| Miera úspešnosti modelu | 73% | 63% |
| Čas od očkovania po experiment | 29 dní (24-31) | 45 dní (36-51) |
| Úspešná injekčná dávka | 1 x 10 7 | 40 x 10 6 |
| (5x106 na maternicový roh) | (20 x 106 na maternicový roh) | |
| Celková miera úspešnosti | 75% | |
| Celková úspešnosť pred stehom maternice | 57% | |
| Celková úspešnosť po zašití maternice | 81% | |
Tabuľka 1: Údaje modelu vrátane experimentálnych podmienok, počtu použitých zvierat a miery úspešnosti. Dva králiky pôvodne použité pre kultivované bunkové nádory, ktoré nerástli, sa neskôr použili pre nádorové modely in vivo
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Diskusia
Tu uvádzame štandardizovanú chirurgickú metódu na stanovenie modelu rakoviny endometria VX2 a uvádzame prvé použitie kultivovaných buniek VX2 na vytvorenie tohto modelu. 75% miera absorpcie nádorom je nižšia ako 100% percentná miera predtým uvedená v literatúre 35, 37, 53, 56; avšak miera patologicky potvrdených metastáz v lymfatických uzlinách je 90% v súlade s predchádzajúcimi štúdiami tohto modelu 35, 53 .
Celkovo sme opísali jednoduchú štandardizovanú metódu na modelovanie rakoviny endometria s retroperitoneálnou lymfadenopatiou u králikov. Týmto protokolom sme sa zaoberali významnou variabilitou v literatúre o VX2, pokiaľ ide o dávku buniek, chirurgickú techniku a sledovanie pooperačného modelu. Uznávame, že ďalším obmedzením štúdie je, že keď použijeme bunkovú líniu VX2 namiesto ľudského xenoimplantátu, nenapodobňujeme úplne biológiu nádorov a mikroprostredie ľudskej rakoviny. Dúfame však, že iné skupiny použijú na vytvorenie svojich modelov kultivované bunky VX2, pretože veríme, že tento bunkový typ dokáže spoľahlivejšie modelovať ľudský karcinóm endometria kvôli jeho pomalšiemu rastu a zníženému sklonu k metastatickému-metastatickému ochoreniu. Odporúčame ďalším skupinám, aby pomocou tohto rýchleho a jednoduchého modelu retroperitoneálnych metastáz lymfatických uzlín pochádzajúcich z maternice preskúmali nové zobrazovacie terapie na pomoc pacientom s metastatickým karcinómom endometria.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Zverejnenie
Autori nemajú čo prezradiť.
Poďakovanie
Táto štúdia bola financovaná z Výskumného ústavu Terryho Foxa (PPG-1075), Kanadského inštitútu pre výskum zdravia (Foundation Grant # 154326), Kanadského výskumného ústavu pre rakovinovú spoločnosť (704718), Kanadskej rady pre prírodné vedy a technický výskum, Nadácie pre inovácie a výskum Nadácia pre rakovinu princeznej Margarety.
Chcem dr Ďakujeme spoločnosti Marguerite Akens za poskytnutie prvých buniek VX2 na vytvorenie pôvodného modelu VX2 a zmrazených nádorových blokov VX2. Chcel by som poďakovať Marcovi DiGrappovi za podporu pri uskutočňovaní prvých experimentov s bunkovými kultúrami VX2 a Lili Ding za podporu s bunkovou kultúrou VX2.