Pozorujte, experimentujte, merajte a vyhodnocujte rytmy v organizmoch - PDF na stiahnutie zadarmo
Pozorovanie, experimentovanie, meranie a hodnotenie rytmov v organizmoch Wolfgang Engelmann Ústav botaniky Fyziologická ekológia rastlín Univerzita v Tübingene Auf der Morgenstelle 1 D72076 Tübingen (SRN) Na pamiatku mojich učiteľov Erwin Bünning, Colin S. Pittendrigh a Jürgen Aschoff Tübingen 2004
Vydal Tobias-lib, Univerzitná knižnica Tübingen: URL: http://tobias-lib.ub.uni-tuebingen.de/volltexte/2009/3790/ Licencia: http://tobias-lib.ub.uni-tuebingen.de /doku/licenses/xx.html 5. vydanie 2009 Prvé vydanie sa objavilo v roku 1998 na adrese http://www.uni.tuebingen.de/plantphys/bioclox, druhé prepracované vydanie v roku 2002, tretie prepracované vydanie v roku 2004 4. vydanie V roku 2007 boli revidované texty a obrázky. Anglická verzia je publikovaná v Tobias-lib, Univerzitná knižnica v Tübingene na http://tobias-lib.ub.uni-tuebingen.de/volltexte/2009/3791/, francúzska verzia v Tobias-lib, Univerzitná knižnica v Tübingene, na http://tobias-lib.ub.unituebingen.de/volltexte/2009/3792/ (preklad Pierre Dieumegard). Univerzitná knižnica v Tübingene. Wolfgang Engelmann 2009 Táto kniha bola napísaná v profesionálnom systéme na vytváranie dokumentov LYX (http://www.lyx.org). Používa sádzací systém LATEX. Obrázky vektorovej grafiky boli vytvorené pomocou programu xfig v systéme Linux. Pre diagramy bol použitý PyxPlot. Vďaka Dirkovi Engelmannovi (pomoc s prácou na počítači), Johnovi Dittami (opravy) a Petre Reinhardovej (korektúry), Schneider-Uhle ilustrácie) a študentom (spätná väzba)
Pozorovať. Prijatie mojich vnukov Dirkom Engelmannom 3
Obsah Predhovor 15 Úvod 17 I Metódy a zdroje 19 1 Vedecká práca 21 1.1 Ako vykonávať výskumy. 21 1.1.1 Úvod. 21 1.1.2 Metóda vytvárania viacerých hypotéz. 22 1.1.3 Testovanie hypotéz, analýza a interpretácia údajov. 24 1.1.3.1 Formulovanie hypotéz: pitie kačice. 24 1.1.3.2 Analýza a interpretácia údajov. 25 1.1.3.3 Plánovanie, implementácia a hodnotenie. 27 1.1.3.4 Príklad riešenia problému. 29 1.1.4 Skúšobný protokol. 29 1.2 Vedecká komunikácia. 32 1.2.1 Úvod. 32 1.2.2 Ako uvádzajú vedci svoje výsledky? 32 1.2.3 Vedecká publikácia: príklad. 35 1.2.4 Napísanie vlastného vedeckého článku. 35 1.2.5 Vyhľadávanie literatúry. 36 1.3 Kontroverzie vo vede. 39 1.4 Nevyriešené problémy. 40 2 Metódy registrácie 43 2.1 Video registrácia a hodnotenie rytmov. 43 2.1.1 Úvod. 43 2.1.2 Princíp registrácie. 43 2.1.3 Registrácia. 43 2.2 Evidencia pohybu zvierat pomocou svetelných bariér. 44 2.2.1 Úvod. 44 2.2.2 Princíp registrácie. 44 3 Zobrazenie a analýza časových radov 47 3.1 Úvod. 47 5
Obsah 3.2 Základné pojmy. 47 3.3 Grafické znázornenie časových radov. 48 3.4 Vyhlazovanie. 49 3.5 Prispôsobenie trendov. 50 3.6 Metóda analýzy časových radov. 50 3.6.1 RUN test. 50 3.6.2 Frekvenčné skladanie. 51 3.6.3 Digitálne filtre. 51 3.6.4 Maximálna entropická spektrálna analýza. 53 3.6.5 Priemer signálu. 53 3.6.6 Zobrazenie Actogramu. 53 3.6.7 ČASOVAČKA. 53 3.6.8 MATLAB. 54 4 Práca s modelmi 55 4.1 Úvod. 55 4.2 Modelovanie a simulácia pomocou MODUS. 55 4.3 Modelovanie a simulácia s inými programami. 56 4.4 Modelové príklady rytmov. 56 4.4.1 Model spätnej väzby pre biologické rytmy. 56 4.4.2 Model dravec-korisť. 57 4.4.3 Modelovanie, simulácia s modelom. 58 II Príklady pozorovaní a experimentov 61 5 Ultradiánske rytmy 63 5.1 Úvod. 63 5.2 Chemický oscilátor. 63 5.2.1 Základy. 63 5.2.2 Ukážka. 65 5.2.2.1 Implementácia. 65 5.2.2.2 Vlnová schéma chemickej aktivity. 65 5.2.3 Teplotná závislosť periódy kmitania. 66 5.2.3.1 Ťažkosti a možné chyby. 67 5.3 Gravitropné kyvadlo. 67 5.3.1 Základy. 67 5.3.2 Materiál. 5.3.3 Indukcia pohybu gravitropného kyvadla. 68 5.3.4 Registrácia pohybu kyvadla, grafiky a vyhodnotenia. 68 5.3.5 Návrhy na skúšky. 69 5.4 Rytmy potenia. 69 5.4.1 Základy. 69 5.4.2 Materiál a metódy merania. 72 6
Obsah 11.1 Úvodná literatúra. 123 11.2 Chronobiologické témy pre školy. 123 12 Kurzy na univerzitách, výskumné projekty 127 13 Didaktické hľadiská a koncepty 131 13.1 Pomôcky pre výučbu. 131 13.1.1 Programy a ich popis, príslušné disky. 13.1.2 Filmy, videofilmy, diapozitívy. 13.1.3 Vybavenie, pokyny, laboratórny materiál, zdroje napájania. 13.1.4 Kultivácia testovaných organizmov, zdroje zásobovania. 136 Register 146 Glosár 147 Bibliografia 161 9
Zoznam obrázkov 6.1 Kvety Kalanchoe. 78 6,2 rytmu bunkovej miazgy rastliny CAM. 78 6,3 Kyveta Oxalis. 79 6.4 Registrácia pohybu listov Oxalis. 80 6.5 Anatómia kĺbu Oxalis. 80 6.6 Anatómia kvetu Kalanchoe. 81 6.7 Pohyb okvetných lístkov Kalanchoe a sanie. 81 6,8 Kyveta s kvetmi Kalanchoe. 82 6.9 Pohyb okvetných lístkov Kalanchoe: krivka. 82 7.1 Rytmus Thalassomyxa. 87 7.2 Synchronizovaná kultúra Thalassomyxa. 87 8.2 Actogram muchy domácej. 90 8.1 Príklady denných a nočných zvierat. 91 8.3 Muška domáca. 92 8,5 Klietka na mušky. 93 8.4 Registračný systém. 94 8.6 Registrácia aktivity Drosophila. 95 8.7 Špeciálna pinzeta. 96 8.8 Registračný systém pre násadový rytmus Drosophily. 97 8.10 Metóda sadzí pre násadový rytmus Drosophily: Príklad. 97 8.9 Metóda sadzí pre násadový rytmus Drosophily. 98 8.11 Časy spánku a bdenia batoľaťa. 99 8.13 Priemerný deň rektálnej teploty testovanej osoby. 8.12 Teplotná krivka a spánok/bdenie testovanej osoby. 102 8.14 Denný rytmus a typ chronobiologickej fázy. 103 9.1 Kvetný púčik a vegetatívny púčik Pharbitis nil. 108 9.2 Kritické temné obdobie farbitídy. 109 9.3 Odsávač na prenos múch Drosophila. 110 10.1 Rytmus depozície chitínu. 120 12
Zoznam tabuliek 1.1 Časové body počas pohybu letákov Desmodium. 26 1.2 Časové body a štandardné chyby v bočnom pohybe letáku. 28 1.3 Namerané hodnoty laterálneho pohybu letáku Desmodium. 30 1.4 Pozvánka na prednášku. 33 8.1 Hodnotenie typu chronobiologickej fázy. 100 8.2 Chronobiologický fázový typ rôznych testovaných osôb. 102 13
Časť I Metódy a zdroje 19
1 Vedecká práca Obrázok 1.3: Sýrski škrečky sú aktívne v noci (vľavo) a počas dňa odpočívajú (vpravo) 4 3 Obrázok 1.1: Ďatelina v dennej (vľavo) a nočnej polohe (vpravo), pohľad zhora na vôňu 2 na otázky, na ktoré experimentálne odpovedali hypotézy a potom ich možno testovať v experimentoch: Fenomén Problém Hypotéza Experimentálny test 1.1.2 Metóda formovania viacerých hypotéz a cielený záver Podľa Chamberlaina (1965) a Platta (1964) je vedecká práca uprednostnená, ak sa použije metóda formovania viacerých hypotéz a striktná inferencia (silná inferencia) sa dôsledne uplatňuje. Metóda pozostáva z nasledujúcich krokov: 1 0 0 4 8 12 16 20 24 denný čas [hodiny] Obrázok 1.2: Odhad intenzity vône kvetov Exacum affine ako funkcia denného času tromi rôznymi ľuďmi. Najsilnejšia vôňa v skorých popoludňajších hodinách. Priemerné hodnoty 22
1 Vedecká práca Pohyb bočného letáku 80 60 40 20 690 700 710 720 730 740 750 Čas [min] Obrázok 1.6: Časový priebeh pohybu bočného letáčika Desmodium motorium Tabuľka 1.1: Časy maxim, minim a bodov obratu pohybu bočného letáka Desmodium nie Maximum Maximum bod obratu nahor bod obratu po dole 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 26
1 Vedecká práca Tabuľka 1.3: Tabuľka na zadanie nameraných hodnôt pohybu laterálneho letáku Desmodium Čas (s) 15 25 35 Čas (s) 15 25 35 0 0 15 15 30 30 45 45 60 60 75 75 90 90 105 105 120 120 135 135 150 150 165 165 180 180 195 195 210 210 225 225 240 240 255 255 270 270 285 285 300 300 315 315 330 330 345 345 360 360 375 375 390 390 405 405 420 420 435 435 450 450 465 465 480 480 495 495 510 510 525 525 30
1.2 Vedecká komunikácia SÉRIA Kolokvií ŠPECIÁLNEHO VÝSKUMNÉHO OBLASTI 45 Rečník: Téma: Lokalita: Prof. Dr. C. S. Pittendrigh Stanford Univ., USA Cirkadiánna rytmus: evolucionistický pohľad Zoologisches Institut Frankfurt Siesmayerstr. 70 Malá prednášková sála Čas: štvrtok 17. decembra 1987 18:30 Hostia sú srdečne vítaní podpísaní Prof. Dr. G. Fleissner Ďalej si všimnite seminár s profesorom Pittendrighom, ktorý sa koná nasledujúce ráno o fotoperiodizme: Rečník: Prof. Dr. C. S. Pittendrigh Téma: Evolučná úprava kritickej dĺžky dňa pre zmenu zemepisnej šírky Čas: piatok 18. decembra 1987, 9:30 Miesto: Zoologický inštitút vo Frankfurte nad Mohanom, konferenčná miestnosť (2. poschodie) Siesmayerstr. 70 Frankfurt, 1. decembra 1987 Tabuľka 1.4: Pozvánka na prednášku 33
1 Vedecká práca Obrázok 1.9: Príklady z experimentálneho protokolu: Tabuľky obsahu Obrázok 1.10: Príklady z experimentálneho protokolu: Vstupná strana 34
1.2 Vedecká komunikácia Obrázok 1.13: Predná strana aktuálneho obsahu (vľavo), strana z indexu (vpravo hore) a príklad stránky s obsahom časopisu (vpravo dole). Pod cirkadiánnymi rytmami vpravo hore je 127 41. Na strane 127 (vpravo dole) je stránka s obsahom časopisu Journal of Interdisciplinary Cycle Research. Na strane 41 je práca o cirkadiánnych rytmoch, ktorú napísali Queiroz-Claret a Queiroz 37
1 Vedecká práca Obrázok 1.12: Titulné stránky štyroch časopisov špecializovaných na chronobiologickú prácu: Journal of Biological Rhythms, Biological Rhythm Research (predtým: Journal of Interdisciplinary Cycle Obrázok 1.11: Príklad z vedeckého výskumu), Chronobiology International, Citation Index. Dielo J. Aschoffa Chronobiologia (už sa neobjavuje) v Zeitschrift für Tierpsychologie 49, strana 225 z roku 1979, publikoval M. Ferrer v Comp. Bioc. A. 107, 81 (1994) a R.V. Peters, Brain Res., 639: 217 (1994), citácia 38
1 Vedecké práce 42
3 Reprezentácia a analýza časových radov 0 Modulo 24 0 Modulo 24,2 7 7 dní 14 dní 14 21 21 0 6 12 18 24 Denný čas 0 6,05 12,1 18,15 24,2 Denný čas Obrázok 3.4: Metóda frekvenčného skladania: Pásy aktivity zobrazené v 24-hodinovej mriežke (vľavo ) sa na pravom obrázku rozdelili na kúsky, takže aktivita zvierat medzi 7. a 24. obdobím je zhruba pod sebou. Os x už nezodpovedá 24 hodinám, ale dĺžke periódy v tejto časti (asi 24,2 hodiny). Podľa Ralph a kol. (1996) 15 20 dní 25 30 35 0 6 12 18 24 denná doba (hodiny) Obrázok 3.5: Stanovenie obdobia pomocou sklonu čiary najlepšej zhody Dĺžka periódy je 24,6 hodín (čo je zrejmé aj z porovnania polohy najvhodnejšej čiary 25. deň (12.00 hod.) A 35. deň (18.00 hod.): Rozdiel je 6 hodín vydelený 10 (35–25) dáva 0,6 (24 + 0,6 = 24,6) 52
4.4 Modelové príklady Simulovali sa rytmy a komotorické správanie u potkanov (Diez-Noguera (1994)) a mušiek (Helfrich-Förster a Diez-Noguera (1993)). Je založený na spriahnutých oscilátoroch, ktorých vlastnosti sa navzájom mierne líšia. Táto situácia je v organizmoch bežná. 59
4 Práca s modelmi 60
Časť II Príklady pozorovaní a experimentov 61
5 Ultradiánske rytmy Uhol [stupne] 40 20 0 20 40 0 4 8 12 16 Čas [hodiny] Obrázok 5.5: Priebeh pohybu gravitropného kyvadla hypokotylu cisárskeho vetra po 30 minútach gravitropného podráždenia Epidermálna bunka Sekundárna bunka Guard bunka Dýchacia dutina Obrázok 5.6: Prístroj na otváranie trhlín v liste ovsenej rastliny. Vľavo: prierez, vpravo: pohľad zhora. Za ochrannými bunkami v tvare činky (vpravo) nasleduje každá sekundárna bunka, ktorá zasa susedí s bunkami epidermy. Dýchacia dutina ako súčasť medzibunkového systému 70
5.4 Rytmy potenia 1800 Potenie 1600 1400 1200 50 0 50 100 150 200 250 Čas [min] Obrázok 5.7: Rytmický priebeh potenia v ovsenom liste. V čase 0 sa rastlina predtým držaná v tme ožarovala bielym svetlom. Výsledkom sú transpiračné oscilácie (relatívne jednotky) normálny stav vody + _ obsah vody v sekundárnych bunkách obsah vody v ochrannej bunke _ + otvorenie priedušiek absorpcia vody akútny stav vody potenie Obrázok 5.8: Ako vznikajú potné oscilácie v ovsenom liste: Schéma spätnoväzbového obvodu. Aktuálny stav dodávky vody sa porovnáva s požadovanou hodnotou (v hornom kruhu so znamienkami + a -). Ak existuje rozdiel, používa sa to ako chybový signál na ovplyvnenie šírky priedušiek (prieduchy zatvorte, ak je hladina vody príliš nízka, otvorte ju, ak je príliš vysoká). Pre vznik vibrácií sú dôležité časové oneskorenia 71
5.5 Registrácia pohybov pomocou Desmodia 5.5.3 Experiment Lítiové ióny spomaľujú osciláciu v mnohých cirkadiánnych rytmoch. Malo by sa skontrolovať, či to platí aj pre ultradiánny rytmus Desmodium motorium. Popremýšľajte, ako by ste vykonali experiment. Aké koncentrácie by ste použili, ako dlho by ste nechali merania bežať, ako vyzerajú kontrolné testy? 75
6 Denné rytmické procesy v rastlinách Videokamera Zelená žiarivka Obrazovka Kvetinová kyveta Digitizér Plexisklo disk 0,2 M Cukorové riešenie Obrázok 1110000 1111 000000000000 111111111111000 1110000 1111 Počítač 000000000000 11111111111111 0000 1111 000000000000 111111111111 0000 1111 Obrázok: polyuretánové kvetinové stonky s otvormi pre stonku kvetu . Osvetlenie dvoma zelenými žiarivkami, navyše zabalené zelenou fóliou. Registrácia pomocou videokamery a digitalizácia obrazu pomocou snímača snímok a počítača. Kvety sú zobrazené na monitore Obrázok 6.9: Originálna krivka a digitálne filtrovaná krivka pohybu okvetného lístka Kalanchoe 82
6 Denné rytmické procesy v rastlinách ger (1988), Overland (1960)). Dôvodom je často adaptácia na opelenie hmyzom. Preskúmajte rôzne kvitnúce rastliny a porozmýšľajte, ako otestovať citlivosť nosa. 84
8 Denné rytmické procesy u zvierat a ľudí 01-07 11-39 dní 5 10 15 20 25 30 35 0 6 12 18 24 Denný čas (dvakrát denne) Obrázok 8.2: Príklad aktogramu (druh tachografu) muchy domácej, jej pohybová aktivita bol zaregistrovaný počas prvých 7 dní v 12:12 hodinovej zmene svetlo-tma a potom počas 30 dní v konštantných podmienkach so slabým červeným svetlom pri 22 ° C. Činnosti po sebe nasledujúcich dní pod sebou, denný čas vykreslený vodorovne (mierka od 0 do 24 hodín, ale každý deň bol vykreslený dvakrát (dvojité vykreslenie). Údaje boli získané metódou záznamu obrazovej analýzy popísanou a zobrazenou pomocou grafického programu -Začiatky sa dajú použiť na určenie obdobia 90
8.3 Ľudské denné rytmy Videokamera Obrazovka Digitizér Obrázok počítača Hrdzavá sklenená doska Skrinka Sklenená doska Nylonová sieť Mŕtva mucha Červená žiarivka Biela papierová fólia Bábika zo sadzí Obrázok 8.8: Záznamový systém na meranie liahnutia muchov Drosophila z pupária pomocou videokamery, digitizéra a počítača pomocou prístroja Metóda sadzí. Svetlo z dvoch červených žiariviek odráža biely papier na spodnú stranu držiakov pre bábiky, z ktorých jeden je zobrazený podrobnejšie v pravej dolnej časti obrázka: Kovová platňa s otvormi 10 * 10, každá s bábikou. Biela sieťka s jemnými okami zabráni vypadnutiu bábik. Vyliahnuté mušky utierajú sadze zo spodnej strany sklenených dosiek. V týchto bodoch kamera vidí červené svetlo (pozri obrazovku a obrázok 8.9). Údaje sa ukladajú a vykresľujú ako funkcia času (pozri obrázok 8.10) Šrafovanie 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 Čas [dni] Obrázok 8.10: Príklad krivky rytmického šrafovania druhu Drosophila pseudoobscura. Údaje sa získali registráciou sadzí a opísanou digitalizáciou videa a zobrazili sa v programe OXALDIFI 97
8 Denné rytmické procesy u zvierat a ľudí Telesná teplota [C] 38 37 0 1 2 3 4 5 6 7 8 dní Obrázok 8.12: Priebeh rektálnej teploty a periódy spánku a bdenia testovanej osoby. Spánok: tmavý, doba bdenia: svetlé pruhy Tabuľka 8.2: Chronobiologický fázový typ rôznych testovaných osôb Priezvisko Meno M/F vek typ tepl. Min. 102
8 Denné rytmické procesy u zvierat a ľudí Príklad: 20:00 21:00 22:00 23:00 24:00 01:00 02:00 03:00 20:00 21:00 22:00 23:00 24:00 01: 00 02:00 03:00 Uveďte čas, kedy obvykle vstávate. 05:00 06:00 07:00 08:00 09:00 10:00 11:00 12:00 Uveďte, či ste zajtra alebo večer aktívnym človekom. 5 Mimoriadne aktívny zajtra. 4 Ráno mierne aktívny. 3 Ani jedno, ani druhé. 2 Stredne aktívny večer. 1 Mimoriadne aktívny večer. Vyhodnotenie dotazníka je uvedené v tabuľke 8.1 106
9 Význam cirkadiánnych rytmov: fotoperiodizmus Obrázok 9.3: Odlučovač na prenos múch Drosophila Po (2) 3 týždňoch skontrolujte vývoj samíc u samíc (samce sú ľahko rozpoznateľné podľa červeného semenníka). Za týmto účelom uchopte brucho dvoma špicatými hodinárskymi pinzetami vpredu a vzadu, roztrhnite ho a pozrite sa na vaječný žĺtok vo vode s 25-násobným zväčšením. Vyvinuté vaječníky sú oveľa väčšie. Na 100 múch potrebujete na vyšetrenie asi 15 minút. Pri každom čítaní preskúmajte približne 200 múch z rôznych kultúr. Pripravte tabuľku s hodnotami a zobrazte ich graficky (% diapauza v závislosti od dĺžky svetelného obdobia). 110
Časť III Rytmy v triede 111
9 Význam cirkadiánnych rytmov: fotoperiodizmus 114