Priestorová kvantifikácia liekov v léziách pľúcnej tuberkulózy pomocou laserovej mikrodisekcie

Zhrnutie

Tu opisujeme protokol využívajúci laserovú mikrodisekciu spárovanú s LC/MS analýzou na kvantifikáciu distribúcie priestorového liečiva v granulómoch pľúcnej tuberkulózy. Tento prístup má široké uplatnenie na kvantifikáciu koncentrácií liečiva v tkanivách pri vysokých priestorových detailoch.

Abstrakt

Úvod

Schopnosť priestorového rozlíšenia a kvantifikácie hladín liečiva je nevyhnutná na určenie toho, či antituberkulózne liečivá dosahujú bakteriálne subpopulácie v pľúcnych léziách pri sterilizačných koncentráciách 1. Osobitne dôležitá je penetrácia liečiva do nekrotického jadra lézie (nazývaná caseum), pri ktorej sa určuje, ktorá obvykle obsahuje najvyšší počet bacilov a pravdepodobne zle dostupné lieky z dôvodu nedostatočnej vaskularizácie.

Tradičné metódy penetrácie lézií, ktoré hodnotia homogenizáciu vyrezaných pľúcnych lézií, po ktorej nasleduje extrakcia rozpúšťadlom a analýza kvapalinovej chromatografie-hmotnostnej spektrometrie (LC/MS), sú veľmi citlivé a selektívne pre príslušné lieky. Tieto metódy však poskytujú zlú priestorovú informáciu, obmedzenú na veľkosť pôvodného homogenizovaného tkaniva. Zobrazovacie prístupy založené na hmotnostnej spektrometrii, ako je laserová desorpčná ionizácia s asistenciou matice (MALDI) 2, 3, desorpčná elektrosprejová ionizácia (DESI) 4 alebo extrakcia s povrchovou úpravou kvapalinou 5, 6, ponúkajú veľmi priestorovo rozlíšené zobrazovacie schopnosti, ale priama kvantifikácia môže byť mimoriadne náročná alebo nemožné z dôvodu účinkov potlačenia heterogénnych iónov a rozdielnej účinnosti extrakcie analytov z jednotlivých buniek alebo tkanív 7. Okrem toho väčšina prístupov priameho zobrazovania tkanivovej MS je vo svojej podstate menej citlivá ako LC/MS kvôli chýbajúcej chromatografickej separácii endogénnych druhov, ktoré by konkurovali ionizácii, a nižšej účinnosti extrakcie liečiva z tkaniva rozpúšťadlom.

Tento protokol popisuje účinnú kombináciu priestorového profilovania a úplnej kvantifikácie LCM-LC/MS, ktorá ponúka absolútne koncentrácie liečiva vo všetkých kompartmentoch ponúkaných TB granulómov. Táto technika sa môže použiť aj na stanovenie koncentrácií liečiva v mnohých rôznych chorých tkanivách, aby sa informoval o dôležitom objave a vývoji liečiva.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Všetky testy na zvieratách sa uskutočňovali podľa Sprievodcu starostlivosťou a používaním laboratórnych zvierat v National Institutes of Health so súhlasom Výboru pre inštitucionálnu starostlivosť a použitie zvierat NIAID (NIH), Bethesda, MD.

(1) Testovanie na zvieratách a odber tkanív

Táto časť protokolu popisuje postupy na zvieratách a podmienky odberu biologickej bezpečnosti úrovne 3 (BSL3) pri odbere vzoriek. Pre podrobné protokoly týkajúce sa postupu pri infekcii a podávaní liekov s aerosólom Mycobacterium Tuberculosis boli protokoly u králikov opísané skôr 11, 12 .

(4) Extrakcia a analýza LCMS

5. validácia metódy

  1. Vytvorte homogenát v kontrole pľúcneho tkaniva kombináciou 1 dielu pľúc, 2 dielov PBS a 3-4 oceľových guľôčok. Pľúcne tkanivo a PBS pufrujte 5 minút pri 1750 ot./min pomocou guľôčkového homogenizátora.
  2. Homogenát sa obohatil pridaním 10 ul 1 mg/ml zásobného roztoku etambutolu DMSO v 990 ul homogenátu, aby sa vytvorila konečná koncentrácia 10 000 ng/ml (10 mg/ml) a zmes sa miešala 1 minútu.
  3. Vytvorte zmrazený blok homogenátu naliatím homogenátu do Cryomoldu a jeho rýchlym zmrazením na suchom ľade po dobu 5 minút.
  4. Pripravte si 25 um hrubé rezy z bloku homogenátu, ako je opísané v 2.1-2.5.
  5. Disekujte cieľové tkanivo, ako je uvedené v krokoch 3.2-3.10.
  6. Do skúmaviek s mikrodisekovaným tkanivom pridajte 10 ul acetonitrilu/vody 1: 1 a 2 ul PBS pufru.
  7. Do každej skúmavky pridajte 50 ul extrakčného roztoku. Kroky na vytvorenie štandardnej krivky a stanovenie koncentrácie liečiva v bloku tkanivového homogenátu 4.9-4.12.
  8. Účinnosť extrakcie vypočítajte pomocou nasledujúceho vzorca:

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Prehľad prístupu LCM-LC/MS je uvedený na obrázku 1zobrazené. Po sterilizácii tkaniva gama žiarením prebiehajú všetky ďalšie kroky (odrezanie tkaniva) mimo podmienok BSL3. Obrázok 2 ukazuje rezy biopsie lézie pred a po tkanive izolovanom z LCM. Nekrotické a bunkové oblasti TB lézií možno ľahko identifikovať a izolovať iba vizuálnou kontrolou optických obrazov (bez nutnosti odkazovať na histologicky zafarbené rezy susedných tkanív). Proces disekcie vytvára čistý rez s minimálnym narušením okolitého tkaniva a disekcia 3 miliónov µm 2 (3 mm2) každej oblasti záujmu z lézií trvá celkovo približne 1 hodinu.

Aplikovali sme LCM-LC/MS kvantifikáciu priestorovo mnohých existujúcich a nových anti-TB liekov v pľúcnych léziách. Obrázok 3A ukazuje vzorové údaje od MTB-infikovaných králikov, ktorým bol v rovnovážnom stave dávkovaný etambutol. LCM-LC/MS umožnili úplnú kvantifikáciu liečiva v rozpustenom kaseu, bunkovej lézii a nezúčastnených oblastiach pľúcneho tkaniva. Bolo pozorované, že EMB preniká do lézie rovnako a dosahuje sterilizačnú koncentráciu v nekrotickom prípade. Zodpovedajúci obraz MALDI-MS získaný predajom EMB zo susedného tkaniva je znázornený na obrázku 3b. Kvalitatívne obrázky MALDI-MS dobre korelovali s kvantitatívnymi údajmi LCM-LC/MS s nižšími koncentráciami liečiva zistenými v nekrotickom prípade v porovnaní s bunkovým okrajom. Údaje LCM-LC/MS sa overili priamym porovnaním s tkanivovými homogenátmi analyzovanými štandardnými LC/MS.

kvantifikácia

ilustrácia 1 : Schematický proces LCM-LC/MS. Bunkové biopsie pľúc s nekrotickými léziami spolu s okolitými nezúčastnenými pľúcami sa odoberú a zmrazia. Kryosekcie sa narežú na tenké membrány PET a nerozvinuté pľúcne, bunkové a kazeozálne lézie sa disekujú a izolujú na kvantifikáciu pomocou LC/MS. adaptované od Zimmerman et al. 12 Pre väčšiu verziu tohto obrázka kliknite sem.

tuberkulózy

Obrázok 2 : Lézie (A, B) a nezúčastnené pľúca (C, D), ktoré sa objavia pod mikroskopom pred (A, C) a po (B, D) mikrodisekcii. Oblasti lézií kazeózy sú na optickom skenovaní obrazu tmavšie a „prasknuté“ (A, zelený obrys). Bunková lézia je svetlejšej farby a má pevnejšiu štruktúru (A, červený okraj). Nezapojené pľúca by mali byť palpované najmenej 5 mm od hranice lézie a mali by mať červeno-ružovú farbu (C, azúrový obrys). Mierka (čierna, modrá a fialová) = 400 µm. Pamätajte, že by sa mali vyberať iba oblasti nezúčastnených pľúc, aby sa zabránilo zahrnutiu alveolárnych priestorov a bronchiolov zachytených na celom povrchu tkaniva (pozri d). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Členitá plocha (µm - 2) EMB konc. (Ng/g) namerané (n = 3) Obnova EMB (%) (n = 3)
3 milióny 10633 (± 404) 106 (± 4)
5 miliónov 10057 (± 1132) 101 (± 11)
10 miliónov 10563 (± 1128) 105 (± 11)

Stôl 1: Účinnosť extrakcie metódy LC-LC/MS na kvantifikáciu EMB v pľúcach. Kompletná obnova EMB zaznamenala hombenátom rozrezaným pľúcnym tkanivom dopovaným EMB všetky hodnotené objemy tkanív.

ID králika LC/MS EMB (ng/g) LCM-LC/MS EMB (ng/g) Rozdiel (%)
899 2910 3320 14
904 2010 1870 -7.
911 2150 2370 9

Tabuľka 2: Porovnanie EMB kvantifikácie nezapojených biopsií pľúc od 3 dávkovaných králikov pomocou LCM-LC/MS. a LC/MS Ekvivalentné koncentrácie liečiva detegované metódami a počas procesu LCM-LC/MS sa nepozorovala žiadna strata signálu degradáciou alebo aspiráciou.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Na stanovenie, či expozícia liečivu dosiahla sterilizačné koncentrácie bakteriálnych populácií nachádzajúcich sa v rôznych kompartmentoch lézií, je potrebná priestorovo rozlíšená kvantifikácia liekov v pľúcnych léziách TB. Tu opísaná metóda LCM-LC/MS umožňuje absolútnu kvantifikáciu liekov proti TBC u všetkých subjektov lézie, vrátane kazumu bohatého na baktérie, s celkovým počtom iba 1 - 3 rezov. Tradičná homogenizácia tkaniva a LC/MS prístupy ku kvantifikácii liečiva v tkanive často postrádajú priestorové vlastnosti, ktoré by vyhovovali konkrétnym kompartmentom lézií, a aj keď je to možné, existuje značný potenciál kontaminácie krížovými bunkami a oblastí nekrotických lézií počas manuálnej extrakcie.

Protokoly na farbenie tkanív sa typicky používajú pred LCM na proteomické aplikácie, ktoré umožňujú ľahkú identifikáciu oblastí tkaniva a nachádzajú sa v bunkových populáciách. Rutinné histochemické škvrny ako napr B. H&E nie sú kompatibilné s kvantifikáciou liečiva, pretože mnoho zahrnutých krokov premytia rozpúšťadlom by liečivo previedlo z tkanivovej časti do druhej. Susedné polotovary je možné zafarbiť pomocou H&E a použiť ako vodítko pre mikrodisekciu. Zvyčajne to však nie je potrebné, pretože kompartmenty lézií je možné sledovať pod štandardným mikroskopom LCM s jasným poľom (obrázok 2).) je možné vyriešiť.

Optimalizácia krokov rezania a mikrodisekcie je rozhodujúca pre úspešnú kvantifikáciu lézie. Počas vývoja metódy sme vyhodnotili dva rôzne membránové materiály, polyetyléntereftalát (PET) a polyetylénnaftalát (PEN) ako substráty na zostavenie tkanivových rezov na mikrodisekciu. PEN membrány utrpeli zvýšený statický náboj v porovnaní s PET membránami a približne 30% všetkých disekovaných oblastí tkaniva sa stratilo v dôsledku statickej príťažlivosti medzi membránou a oblasťou disekovaného tkaniva. Z tohto dôvodu boli pre budúce disekcie vybrané membrány PET kvôli výrazne zníženej pozorovanej statickej príťažlivosti (iba 5% oblastí disekovaných z membrán PET sa stratilo počas LCM).

Hustota disekovaných oblastí tkaniva je tiež dôležitým aspektom pri kvantifikácii hladín liečiva na základe plochy alebo objemu tkaniva. To má osobitný význam pre biopsie pľúc a lézií, pri ktorých majú nezúčastnené oblasti pľúcneho tkaniva celkovo nižšiu hustotu ako bunky a kaseum (menej tkanív, ktoré majú rovnakú relatívnu plochu) v dôsledku prítomnosti viacerých otvorených bronchiolov a alveolárnych priestorov. Účinky tohto rozdielu v hustote je možné zmierniť pozorným rozhliadnutím sa po otvorených plochách, vrátane tých v nahromadenej oblasti zhromaždených tkanív (ako je znázornené na obrázku 2)zobrazené).

Ďalším obmedzením je, že prezentovaná metóda LCM-LC/MS iba kvantifikuje celkovú koncentráciu liečiva v izolovanom tkanive (spolu so všetkými prístupmi homogenizácie tkaniva, extrakcie rozpúšťadlom a LC/MS kvantifikáciou) a nerozpúšťa koncentrácie liečiva viazaného na proteín z neviazaných zlomov. Mikrodialýza je alternatívnym prístupom ku kvantifikácii neviazaného liečiva v tkanive a umožňuje presnú kvantifikáciu koncentrácií voľného liečiva dosahujúcich extracelulárne populácie baktérií 13. Táto technika by sa však mala najlepšie použiť ako doplnkový prístup, pretože postráda priestorové špecifiká LCM-LC/MS a kvantifikuje iba hladiny rozpustného liečiva v hierarchii extracelulárnej tkanivovej tekutiny, nie intracelulárneho obsahu.

Prvýkrát sme kombinovali LCM a LC/MS na priestorovú kvantifikáciu antibiotík v mieste infekcie tuberkulózy. Metodika je nesmierne účinná, pretože sa dá aplikovať na akýkoľvek liek s malou molekulou v ktoromkoľvek štádiu choroby. V skutočnosti sme nedávno kvantifikovali kandidáta na fungicídny liek na myšom modeli brušnej kandidózy 14. Diferenciálne rozdelenie liekov na heterogénne kompartmenty nádorov (vrátane nekrotických jadier) je hlavným problémom pri liečbe rakoviny a kritickou oblasťou výskumu objavu liekov proti rakovine15. LCM-LC/MS je ideálne vhodný na riešenie týchto otázok. LCM-LC/MS je navyše užitočný na objavenie biomarkerov na kvantifikáciu metabolických, lipidomických a proteomických zmien vyskytujúcich sa v tkanivových oblastiach a bunkových populáciách počas patogenézy ochorenia.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.