Pripravil Nemecký inštitút pre výskum výživy. Predložené katedrou

Dizertačná práca A. Winchenbach vyrobená v Nemeckom ústave pre výskum výživy Predložila Katedra veterinárneho lekárstva Slobodnej univerzity v Berlíne Vyšetrenie nevyhnutnosti živých mikroorganizmov pre podporu hydrolýzy laktózy v čreve mikrobiálnou ß-galaktozidázou fermentovaných mliečnych výrobkov na základe inauguračnej dizertačnej práce s obsahom gnotobiotika Göttingen minipig Súbor doktorov: /// g /Sassadat/Diss/UB/winch/index.htm (1 zo 6) [07/03/2000 18:54:54]

inštitút

Dizertačná práca A. Winchenbacha z veterinárneho lekárstva na Slobodnej univerzite v Berlíne, ktorú predložil veterinárny lekár Andrea Winchenbach zo Salzhemmendorf Berlin 1998 Číslo časopisu: 2172 Obsah Page 1. Úvod 1 2. Zoznam literatúry 3 2.1. Malabsorpcia laktózy 3 2.2. Prehľad druhov choroboplodných zárodkov použitých pri výrobe fermentovaných mliečnych výrobkov 7 2.3. Ss-galaktozidázy 8 2.3.1. Črevná (vlastná) ß-galaktozidáza 8 2.3.2. Mikrobiálna ß-galaktozidáza 12 2.4. Tolerancia fermentovaných mliečnych výrobkov malabsorbérmi laktózy 2.5. Zabíjanie „mikroorganizmov“ alebo „laktobacilov“ γ lúčmi 13 18 súbor: /// g /Sassadat/Diss/UB/winch/index.htm (2 zo 6) [03.07.2000 18:54:54]

Dizertačná práca A. Winchenbach 3.3.2. Získanie slizničných homogenátov s následným stanovením intestinálnej aktivity ß-galaktozidázy u miniprasiatka Göttingen 3.3.3. Získanie slizničných homogenátov s následným stanovením intestinálnej aktivity β-galaktozidázy u potkanov 3.3.4. Stanovenie aktivity ß-galaktozidázy a usmrcovanie zárodkov v suspenziách laktobacilov po pôsobení ionizujúceho žiarenia 3.4. Skúmanie trávenia laktózy a aktivity ß-galaktozidázy u gnotobiotických miniatúrnych ošípaných v Göttingene 41 42 42 44 3.4.1. Pokusné zvieratá 44 3.4.2. Vedenie 44 3.4.3. Diéty 45 3.4.4. Pokus o kŕmenie 46 3.4.5. Odber vzoriek a ošetrenie 47 3.4.6. Sterilné ovládacie prvky 47 3.5. Skúmanie trávenia laktózy a aktivity ß-galaktozidázy u gnotobiotických potkanov 48 3.5.1. Pokusné zvieratá 48 3.5.2. Vedenie 48 3.5.3. Diéty 48 3.5.4. Pokus o kŕmenie 49 3.5.5. Odber vzoriek a ošetrenie 49 3.5.6. Sterilné ovládacie prvky 49 3.6. Štatistické vyhodnotenie 50 4. Výsledky 51 4.1. Rastová krivka Lactobacillus delbrückii ssp. bulgaricus 709-1 51 file: /// g /Sassadat/Diss/UB/winch/index.htm (4 zo 6) [03.07.2000 18:54:54]

Dizertačná práca A. Winchenbach 4.8.5. Počty mikróbov v potrave a výkaloch potkanov po podaní životaschopných laktobacilov 73 5. Diskusia 76 5.1. Predbežné skúšky 76 5.1.1. Podmienky rastu a čistota kmeňa laktobacilov použité v experimente 5.1.2. Aktivita ß-galaktozidázy vo vzorkách po štiepení in vitro v zmesi pepsín/HCl 5.1.3. Vlastná aktivita slizničnej ß-galaktozidázy hostiteľa v tenkom čreve miniprasiat a potkanov Göttingen 5.1.4. Vplyv ožarovania lúčmi γ na aktivitu ß-galaktozidázy a stav klíčenia Lactobacillus delbrückii ssp. bulgaricus 5.2. Množstvo laktózy, aktivita ß-galaktozidázy a počet baktérií vo výkaloch gnotobiotických miniprasiatok Göttingen po konzumácii troch rôzne pripravených kefírových diét 5.3. Množstvo aktivity laktózy, ß-galaktozidázy a počet baktérií vo výkaloch gnotobiotických potkanov po konzumácii troch rôzne pripravených jedál z kefíru 76 77 79 80 83 90 6. Zhrnutie 92 Zhrnutie 7. Bibliografia 94 8. Zoznam skratiek 114 9. Príloha 115 Poďakovanie Súbor CV: ///g /Sassadat/Diss/UB/winch/index.htm (6 zo 6) [07/03/2000 18:54:54]

Dizertačná práca A. Winchenbach - Kapitola 4: Výsledky 4. Výsledky 4.1 Rastová krivka Lactobacillus delbrückii ssp. bulgaricus 709-1 Pre prácu bolo nanajvýš dôležité dosiahnuť čo najväčší výťažok laktobacilov s obsiahnutou ß-galaktozidázou. Z rodu Lactobacillus delbrückii ssp. bulgaricus 709-1 pripravil jeden deň príkladnú rastovú krivku, dalo by sa prečítať, že po inkubačnej dobe 14 hodín sa dosiahol bod, v ktorom sa logaritmická fáza rastu zárodkov zmení na stacionárnu fázu, t. Zárodky by sa preto mali, pokiaľ je to možné, zozbierať a spracovať po 14 hodinách, aby sa získalo optimálne množstvo živých zárodkov. Obrázok 1 zobrazuje krivku rastu Lactobacillus delbrückii ssp. bulgaricus 709-1. Obrázok 1: Rastová krivka pre Lactobacillus delbrückii ssp. bulgaricus 709-1, kultivácia v bujóne MRS pri 37 ° C, indikácia jednotiek tvoriacich kolónie v log (pozri tiež tabuľku 3 v prílohe). 4.2. Kontrola čistoty kmeňa laktobacilov: /// g/Sassadat/Diss/UB /winch/results.htm (1 z 26) [07/03/2000 18:57:06]

Dizertačná práca A. Winchenbach - Kapitola 4: Výsledky d. Pri pH 4 a meraní celkovej β-galaktozidázy (po pôsobení ultrazvuku) bol všeobecne zaznamenaný pokles v ožiarených vzorkách počas celej doby merania. Po inkubácii pri teplote 37 ° C počas 120 minút bolo vo vzorke ožiareného kefíru stále nameraných 519 IU/l a vo vzorke pufra 543 IU/l. V obidvoch neožiarených vzorkách (v obidvoch 1040 IU/l) došlo na začiatku inkubácie po 120 minútach dokonca k zvýšeniu aktivity nad aktivitu 750 IU/l (obr. 5). Obrázok 2: Aktivity voľnej ß-galaktozidázy v 4 rôznych vzorkách s laktobacilmi po inkubácii so zmesou pepsín/HCl pri pH 2 (stanovené s o-npg ako substrátom) (pozri tiež tabuľku 4 v prílohe). neidentifikovaný/puf. = neozářená peleta z laktobacilov resuspendovaná v pufri neznáma./kef. = neožiarená peleta laktobacilov resuspendovaná v kefíre najlepšie./kúp. = Lactobacilli pelety ožiarené 20 kg resuspendovaním. v nárazníkovom poradí/kľúč = Lactobacilli pelety ožiarené 20 kg resuspendovaním. v súbore Kefír: /// g /Sassadat/Diss/UB/winch/results.htm (3 z 26) [07/03/2000 18:57:06]

Dizertačná práca A. Winchenbach - Kapitola 4: Výsledky Obr. 3: Aktivity voľnej ß-galaktozidázy v 4 rôznych vzorkách s laktobacilmi po inkubácii so zmesou pepsín/HCl pri pH 4 (stanovené s o-npg ako substrátom) (pozri tiež Tab. 5 v prílohe). neidentifikovaný/puf. = neozářená peleta laktobacilov resuspendovaná v tlmivom roztoku neidentifikovane./kef. = neožiarená peleta laktobacilov resuspendovaná v kefíre najlepšie./kúp. = Lactobacilli pelety ožiarené 20 kg resuspendovaním. v nárazníkovom poradí/kľúč = Lactobacilli pelety ožiarené 20 kg resuspendovaním. v súbore Kefír: /// g /Sassadat/Diss/UB/winch/results.htm (4 z 26) [07/03/2000 18:57:06]

Dizertačná práca A. Winchenbach - Kapitola 4: Výsledky Obr. 4: Aktivity celkovej ß-galaktozidázy v 4 rôznych vzorkách po inkubácii so zmesou pepsín/HCl pri pH 2 (stanovené pomocou o-npg ako substrátu) (pozri tiež Tab. 6 v prílohe). neidentifikovaný/puf. = neozářená peleta z laktobacilov resuspendovaná v pufri neznáma./kef. = neožiarená peleta laktobacilov resuspendovaná v kefíre najlepšie./kúp. = Lactobacilli pelety ožiarené 20 kg resuspendovaním. v nárazníkovom poradí/kľúč = Lactobacilli pelety ožiarené 20 kg resuspendovaním. v súbore Kefír: /// g /Sassadat/Diss/UB/winch/results.htm (5 z 26) [07/03/2000 18:57:06]

Dizertačná práca A. Winchenbach - kapitola 4: Výsledky gnotobiotické, ale stále konvenčné) Krivky priebehu aktivity slizničnej ß-galaktozidázy zobrazené na obr. 6 v 6 rezoch tenkého čreva (namerané pri pH 5,5) u 6 miniprasiat Göttingen boli individuálne pre každé zviera Všeobecne sa však dá zistiť, že aktivity v predných častiach tenkého čreva boli najvyššie až do 50% od výstupu zo žalúdka u takmer všetkých zvierat a potom - s výnimkou ošípaných - ku koncu viac alebo menej silno poklesli. Prasa 6 vykazovalo najvyššiu aktivitu ß-galaktozidázy v sliznici v poslednej časti tenkého čreva. Najvyššia aktivita slizničnej ß-galaktozidázy sa zistila u prasiat 4 so 14,24 IU/g sliznice (vlhká hmotnosť) pri 30% segmentu tenkého čreva, nasledovaných prasaťom 2 s 13,51 IU/g pri 30% a 13,38 IU/g v 50% a z ošípanej 3 s 13,28 IU/g sliznice (vlhká hmotnosť) v 30% časti tenkého čreva zo žalúdočného vývodu. Obrázok 6: Aktivita ß-galaktozidázy pozdĺž tenkého čreva u 12-týždňových miniprasiatok Göttingen (6 zvierat), stanovenie na 6 rôznych častiach tenkého čreva (stanovené s laktózou ako substrátom, pri pH 5,5) (pozri tiež tabuľku 8 v prílohe) ). súbor: /// g /Sassadat/Diss/UB/winch/results.htm (7 z 26) [07/03/2000 18:57:06]

Dizertačná práca A. Winchenbach - Kapitola 4: Výsledky Obr. 8: Vplyv podmienok ožarovania (intenzita a poloha ožarovania) na aktivitu ß-galaktozidázy v peletách laktobacilov; Stanovenie 4 dni v mesiaci (poloha ožarovania 3; bez liečby ultrazvukom; stanoví sa s o-npg ako substrátom) (pozri tiež tabuľku 10 v prílohe). Obr. 9: Vplyv podmienok ožarovania (intenzita a poloha ožarovania) na ß- Aktivita galaktozidázy v peletách laktobacilov; Stanovenie 4 dni v priebehu jedného mesiaca (ožarovacia poloha 7; bez ultrazvukového ošetrenia; stanovené s o-npg ako substrátom) (pozri tiež tabuľku 11 v prílohe) súbor: /// g/Sassadat/Diss/UB/navijak/výsledky. htm (10 z 26) [07/03/2000 18:57:06]

Dizertačná práca A. Winchenbach - Kapitola 4: Výsledky Obr. 10: Vplyv podmienok ožarovania (intenzita a poloha ožarovania) na aktivitu ß-galaktozidázy v peletách laktobacilov; Stanovenie počas 4 dní v mesiaci (poloha ožarovania 3; pri liečbe ultrazvukom; stanoví sa ako substrát o-npg) (pozri tiež tabuľku 12 v prílohe). Obr. 11: Vplyv podmienok ožarovania (intenzita a poloha ožarovania) na ß- Aktivita galaktozidázy v peletách laktobacilov; Stanovenie 4 dni v priebehu jedného mesiaca (ožarovacia poloha 7; s ultrazvukovým ošetrením; stanovené s o-npg ako substrátom) (pozri tiež tabuľku 13 v prílohe) súbor: /// g/Sassadat/Diss/UB/navijak/výsledky. htm (11 z 26) [07/03/2000 18:57:06]