Príroda - dá sa ľahko rozptýliť vetrom, vodou, zvieratami, strojmi, dokumentom PDF

ľahko

ľahko

príroda

vodou

príroda

Dokumenty

IDENTIFIKÁCIA STUPŇA ODOLNOSTI VOČI VLKU (ZÁVOD E)

V NIEKTORÝCH GENOTYPOCH SLNEČNÍKOV

Maria DUCA, Aliona GLIJIN, Victoria POPESCU

Katedra biológie rastlín Molekulárne markery spojené s génmi rezistencie na metlu by umožnili lepšie pochopenie genetického determinizmu

rezistenciu na metlu slnečnicu a uľahčiť skorý výber skríningom prítomnosti niekoľkých špecifických markerov DNA. Poskytli sme analýzu 29 slnečnicových línií so SCAR markerom RTS05 napojených na slnečnicový Or5 locus con-

rezistentná rezistencia na broomrape, ktoré patria k rase E. Identifikácia 650 bp amplikónu pri 27 genotypoch odhalila prítomnosť génu Or5, ktorý chýba v tomto amplifikovanom produkte

na Xenia ♀ a cytoplazmatický mužský sterilný genotyp # 7 naznačuje náchylnosť na rasu E. Úvod Lupoaia je holoparazit krytosemenný, ktorý parazituje na koreňoch poľnohospodárskych plodín, ako je kvetina-

slnko, paradajky, tabak, fazuľa a iné [1]. Slnečnica je napadnutá druhom Orobanche cumana Wallr., Ktorý spôsobuje vážne straty ovocia vo východoeurópskych a stredomorských krajinách [2]. Doteraz bolo identifikovaných päť fyziologických plemien Orobanche (A-E) rôzneho geografického [2,3] a genetického [4] pôvodu. Takže odolnosť voči rase A je určená génom Or; rezistencia na rasu B - génu Or2, ktorá tiež poskytuje rezistenciu na rasu A; rezistencia na rasu C je určená génom Or3, ktorý poskytuje rezistenciu na rasy A a B, respektíve D - Or4 s rezistenciou na A, B a C, ako aj na rasu E - Or5 s rezistenciou na A, B, C a D [5 - 7]. V posledných rokoch bol doložený vzhľad závodov F a G (v Španielsku). Gény rezistencie F boli zistené u niektorých kultivovaných genotypov a divých foriem slnečnice a zdá sa, že spôsobujú rezistenciu k predtým detekovaným plemenám (A-E) [2-4, 8-10].

Kontrola tohto parazita je zložitá, pretože niekoľko tisíc semien vyprodukovaných jednou vlčou rastlinou sa dá ľahko rozptýliť vetrom, vodou, zvieratami, strojmi, pôdou atď., Pričom semená zostanú životaschopné po dobu 10 - 15 rokov [11] a chemickými metódami „Fyzikálne a biologické použitie parazita úplne neodstráni. Alternatívou je použitie plodín odolných voči vlkom, takže v súčasnosti pokračuje výskum zameraný na detekciu a zavedenie génov rezistentných na tento patogén do chovného materiálu [1].

Použitie techniky RAPD [12] v kombinácii s BSA (hromadná segregačná analýza) [13] a použitie molekulárnych markerov úzko spojených s génmi rezistencie umožnilo identifikáciu týchto génov v rôznych rastlinách, ako sú napríklad gény rezistencie voči múke v Laptuca sativa [13], gény rezistencia jačmeňa na Rhynchosporium secalis [14], hrdzu [15] a ďalšie. Po konštrukcii mapy RFLP v slnečnici [16] a BSA boli identifikované markery RFLP spojené s génmi rezistencie na múku PL1, Pl2 a Pl 6 [17-19]. Všetky tri z týchto génov boli spojené s rovnakou sadou markerov RFLP a tvoria zhluk spojovacej skupiny 1 [19].

Cieľom nášho výskumu bolo zistiť prítomnosť génu Or5 v niektorých hybridoch a slnečnicových líniách. Materiál a metódy Charakteristika študijného objektu. Ako rastlinný materiál slúžilo desať kvetinových hybridov (F1)-

(Valentino, Xenia, Performer, Oxana, Vitalia, Drofa, Turbo, Favorit, Alkazar a Olga), rodičovské línie štyroch hybridov (Performer, Oxana, Xenia, Valentino) a 11 genotypov androsterov označených číslami od 1 do 11, resp. Semenný materiál poskytol CCŞ „Magroselect” SRL Soroca.

Podmienky kultivácie in vivo. Rastliny sa pestovali vo vegetačných nádobách pri teplote 24 - 26 ° C, fotoperiodicite 14 - 16 hodín, vlhkosti 60%. Materiál sa zhromaždil a analyzoval vo fáze 6 - 8 pravých listov.

Metódy výskumu Extrakcia DNA. Genomická DNA bola extrahovaná zo slnečnicových listov pomocou DAN-zol [20]. Čistenie

DNA sa robila opakovane zo 100% alkoholu, potom zo 75% alkoholu. Zrazenina získaná po vysušení sa rozpustila v autoklávovanej destilovanej vode. Koncentrácia DNA sa stanovila spektrofotometricky.

PCR reakcia. Amplifikácia sa uskutočňovala so špecifickými primérmi SCAR - RTS05, syntetizovanými na základe počiatočného fragmentu polyméru RAPD - OPJ18_650. Nukleotidová sekvencia markeru SCAR (Alpha DNA, Kanada) je nasledovná:

ŠTÚDIUM A UN UNIVERS I TAT I S

Vedecký vestník Štátnej univerzity v Moldavsku, 2008, č. 2 (12)

F (5´-TGGTCGCAGATGGACGTGTGGGTG-3´), R (5´-GTCGCAGAGAGTGAGAGAGAGTGT-3´). Amplifikačná reakcia sa uskutočňovala v objeme 25 ul, obsahujúcom destilovanú vodu, 5X PCR pufor, zmes

dNTP nukleotidu (2 mM), Taq-polymeráza 1 u/ul (Nemecko), primer 50 bp, AND - 6 ul. Amplifikácia sa uskutočňovala pomocou automatického termocyklu (Corbett, Austrália) za nasledujúcich podmienok: I) denaturácia: 94 ° C - 4 min. (cyklus); II) 45 cyklov, 1) denaturácia: 93 ° C - 1 min., 2) renaturácia: 63 ° C - 1 min., 3) predĺženie: 72 ° C - 4 minúty; III) špecifické predĺženie: 72 ° C - 6 min. Elektroforéza produktov amplifikácie sa dlho uskutočňovala v 1,4% agarózovom géli v TAE pufri.

jednu hodinu pri 80 V. Gély sa vizualizovali UV kamerou a fotografovali. Veľkosť amplifikovaných fragmentov DNA sa porovnala so štandardným markerom (100pb DNA rebrík, Promega, USA).

Výsledky a diskusie Väčšina údajov v literatúre potvrdzuje dominantný monogénny determinizmus rezistencie na rasy A - E

vlkov [3,10,21,22]. Niektoré odkazy však odhaľujú zložitejšie dedičstvo charakteru, vrátane dvoch dominantných génov [8], jedného recesívneho [23], dvojito recesívnej epistaxe [24] alebo dokonca kvantitatívneho dedičstva. Posledné štúdie naznačujú, že odolnosť voči vlkom je určená kvantitatívnymi a kvalitatívnymi polygénnymi mechanizmami [25,26]. Identifikácia genetického determinizmu rezistencie je čoraz viac založená na použití špecifických molekulárnych markerov DNA [26], vrátane molekulárnych markerov spojených s génom Or5, ktoré prepožičiavajú rezistenciu rase E [27] pomocou metódy BSA [13].

Doteraz boli identifikované markery RAPD (UBC120_660) a SCAR markery (RTS05, RTS28, RTS40, RTS29 a RTS41) spojené s Or5 a bola vyvinutá mapa väzbovej skupiny pre gén Or5 v blízkosti 22,5. cM distálne je marker RAPD a od 5,6 cM do 39,4 cM proximálne 5 markerov SCAR. Táto spojovacia skupina bola umiestnená do spojovacej skupiny 17 (LG17) mapy CARTISOL RFLP [27]. Tang (2003), rovnakou metódou (BSA), umiestnil gén Or5 do telomernej oblasti linkerovej skupiny 3 (LG3) po mapovaní SSR markerov [28], pričom najbližší SSR marker bol mapovaný pri 6,2 cM proximálne od lokusu Alebo 5 génov.

V tomto príspevku bolo študovaných 29 slnečnicových genotypov za účelom výskumu génu Or5. Vychádzajúc z výsledkov získaných Lu a kol. (2004), po analýze BSA zistili, že jedným z najbližších SCAR markerov je RTS05 marker mapovaný vo vzdialenosti 5,6 cM proximálne od génu Or5; V našom výskume sme použili tento marker s počiatočným fragmentom priméru RAPD - OPJ18_650 s produktom amplifikácie 650 bp.

INTERPRET OXANA XENIA VALENTINO

Foto 1. Výsledky amplifikácie DNA so špecifickým markerom SCAR (RTS05) v rôznych rodinách slnečnice: M - molekulárne markery; C - kontrola bez DNA.

Analýza získaných výsledkov (Foto.1) na skupinách genotypov (homozygotné otcovské línie a hybrid F1), ktoré tvoria hybridy Xenia, Performer, Valentino a Oxana, ako výsledok amplifikačnej reakcie s dvojicou špecifických primérov uviedla prítomnosť produktu 650 bp vo všetkých genotypoch, s výnimkou materskej línie hybridu Xenia. Údaje, ktoré nám umožňujú predpokladať, že tieto genotypy vlastnia gén Or5 a jeho nedostatok v materskom genotype Xenia - že táto línia je náchylná na E rasu.

Identifikácia lokusu spojeného s génom Or5 sa tiež uskutočnila na 11 androsterilných líniách a 10 slnečnicových hybridoch (fotografie 2 a 3). Amplikón s 650 bp sa získal v androsterilných líniách 1-3, 8-11 a v hybridoch Performer, Oxana, Xenia, Turbo, Favorit, Alcazar a Olga.

Získané výsledky naznačujú, že uvedené línie a hybridy majú odolnosť voči E plemenu vlkov. V 4-6 androsterilných líniách a v hybridoch Valentino, Vitalia a Drofa je amplikón 650 bp slabo zvýraznený a v androsterilnej línii č. 7 chýba.

Podľa údajov z literatúry [2] o priamej súvislosti medzi génmi rezistencie (Or1 - Or7) prítomnými/neprítomnými u druhu Helianthus annuus L. a u plemien (A - G) druhu Orobanche cumana Wallr., Sme teoreticky odvodili citlivosť alebo rezistenciu študovaných genotypov v porovnaní so siedmimi existujúcimi plemenami vlkov (tab. 1-3).