Protokol o vysokom výkone testu spotreby energie Danio Rerio (preložený do nemčiny)
Abstrakt
Úvod
Myš je v súčasnosti dominantným modelom pre výskum obezity. Krátky generačný interval a genetické nástroje, ktoré sú k dispozícii u myši, sú dodnes neprekonateľné. Zebra však má tiež krátky generačný interval (3 - 4 mesiace) a jednoduchou genetickou manipuláciou dokonca prekonáva výkonnosť myši 1,2. Zebra dlhoplutvá udržiava takmer 90% génov cicavcov, zatiaľ čo myš si udržuje počet potomkov a možnosti použitia pri genetických vyšetreniach a vyšetreniach na drogy 3.
Aby sa uvoľnil potenciál modelu zebrafish pre štúdie obezity, je potrebné vyvinúť testy na preskúmanie faktorov, ktoré ovplyvňujú reguláciu hmotnosti vrátane výdaja energie. Ako metabolity sa kyslík spracováva β-oxidáciou a spotrebuje sa cyklus trikarboxylových kyselín a produkuje sa NADH2. NADH 2 je teda priamym indikátorom toku metabolitov metabolickými cestami (oxidácia metabolitov). V poikilotermoch únik H + cez vnútornú mitochondriálnu membránu je oxidácia NADH 2 oddelená od syntézy ATP 4 - 5-krát nižšia ako u teplokrvných zvierat 4. V súlade s tým je NADH 2 v zebrafish veľmi pevne spojený s produkciou ATP prostredníctvom oxidačnej fosforylácie pripojený. Tu popisujeme test, ktorý meria produkciu NADH 2 v larvách zebričiek ako zástupcu spotreby energie 5.
Spotreba kyslíka je zlatým štandardom pre meranie energetického výdaja. Najlepšie však je využiť potenciál vysokej priepustnosti testu na zebričke, pretože pre vysokú priechodnosť musí byť prístupná spotreba energie. Systémy spotreby kyslíka, ktoré závisia od cirkulačného systému s uzavretou komorou, sú svojou priepustnosťou obmedzené počtom prítomných komôr 6. V zebrafish 5.7 boli tiež použité testy spotreby kyslíka/produkcie CO2 na voľnom priestranstve. Tieto 96-jamkové vonkajšie platne od spoločnosti BasisD Systems sú prístupné s vysokou výkonnosťou. Bohužiaľ výmena plynov s prostredím obmedzuje citlivosť týchto testov. Nedávno sme publikovali aplikáciu testu, ktorý monitoruje NADH 2 s redox indikátorom alamarBlue 5. Tento test prekonáva obmedzenia v priepustnosti a citlivosti pri bežných analýzach spotreby kyslíka u rýb.
Zebra pruhovaná je čoraz dôležitejším modelom pre štúdium homeostázy energie celého tela. Čiastočne preto, že zebry sú v budúcnosti prístupné pomocou genetických skríningov a skríningov liekov. Okrem toho je možné rýchlo uplatniť cielenú genetickú manipuláciu vrátane príplatkov a knock-inov. Predtým sme preukázali, že tento test je možné kombinovať s dodávaním liečivých kúpeľov a genetickým doplnkom alebo knockoutom na identifikáciu zlúčenín a génov, ktoré modifikujú rýchlosť metabolizmu 5. Okrem toho je potrebné tento test využiť pre výhody vysokej priepustnosti, ktoré sú charakteristické pre zebrafish.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
POZNÁMKA: Tento protokol sa riadi pokynmi Úradu pre zodpovedný výskum University of Arizona a bol schválený Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat.
1. Chov a údržba embryí zebričiek
2. Pripravte testovací roztok
- Pripravte testovací roztok podľa tabuľky 1. Sterilný filtračný testovací roztok s použitím 0,22 µm filtra. Pred začatím testu zahrejte sterilný testovací roztok vo vodnom kúpeli s teplotou 28,5 ° C.
| zložka | % Z celkového počtu | Objem (ul/10 ml) |
| 60x embryonálne médium E3 | 1,667 | 166,7 |
| Double Deionized (DDI) H 2 0 | 96,233 | 9 623,3 |
| Alamarova modrá- | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0,1 | 10 |
Tabuľka 1 Testovacie médium
4. Posúďte relatívnu zmenu fluorescencie spojenú s liečením
- Zmena fluorescencie z každého výpočtu tiež odpočítaním fluorescencie v čase 0 od fluorescencie na konci štúdie. Studne bez rýb (slepé pokusy) by mali mať hodnoty blízke 0, hlboko pod hodnotami studní, ktoré obsahujú ryby.
Zmena fluorescencie = fluorescencia na konci - fluorescencia v čase 0 - Na určenie relatívnej zmeny fluorescencie vypočítajte priemernú zmenu fluorescencie pre kontrolné jamky, potom vydeľte každú zmenu fluorescencie priemernou zmenou fluorescencie pre kontrolné jamky. Za zmienku stojí, že kontrolami môžu byť buď kontroly vozidla, alebo genetické kontroly.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Nefluorescencia roztoku pri absencii embryonálnych rýb (1) zvýšiť. Test je však veľmi citlivý na malé zmeny rýchlosti metabolizmu vo vrte. Jedna ryba v studni vytvorí jasný signál z prázdnych jamiek do 1 hodiny (je potrebné predplatné P. Odporúčajte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Diskusia
Bakteriálna alebo plesňová kontaminácia výrazne obmedzí použitie tohto testu. Metylénová modrá v embryonálnom médiu E3 obmedzuje možnosť kontaminácie plesňami. Počas celého chovu embryí je dôležité dbať na to, aby sa dvakrát denne odstraňovali mŕtve embryá. Ďalej je dôležité dôkladne testovať embryá sterilným médiom E3 Embryo v deň iniciačnej oblasti testu. Tieto 2 kroky obmedzujú možnosť bakteriálnej kontaminácie embryí. Zahrnutie prázdnych jamiek popísaných v kroku 3.2 umožňuje detekciu akejkoľvek bakteriálnej kontaminácie. Bakteriálna kontaminácia, ktorá dáva merateľný signál, je zriedkavá. Ak však prázdne jamky ukazujú spoľahlivý signál, test by sa mal opakovať a je potrebné dbať na zachovanie čistoty embrya. Ak používateľ predpokladá, že pred insemináciou dôjde ku kontaminácii, môžu byť embryá bielené, ako je opísané vyššie (s. 22) 10. Alternatívne, ak má experimentátor podozrenie, že ku kontaminácii dôjde po odbere, môže užívateľ E2 spätne s penicilínom a streptomycínom používať embryá do 4 dpf (s. 23) 10.
Aj keď je tento test cenný pre použitie v embryách, neskúmali sme jeho platnosť u dospelých zebrafish. Máme podozrenie, že všetky funkcie tohto testu by boli obmedzené u dospelých rýb zlým prienikom AlamarBlue do tkaniva. Okrem toho pri kŕmení rýb môže črevná flóra produkovať hlboký signál, ktorý nemá žiadny význam pre metabolizmus rýb. Tento test má teda úžitok z použitia u vaječných žĺtkov, ktoré kŕmia embryonálne ryby. Relatívna nečinnosť embryonálnych rýb ponúka jedinečnú výhodu, pretože obmedzuje variabilitu, ktorá by bola spojená s výdajom energie vyvolaným aktivitou 11. Tento test je teda jedinečným nástrojom na štúdium rýchlosti metabolizmu v reakcii na genetickú alebo farmakologickú manipuláciu v celom živočíšnom systéme.
Zebrička sa rýchlo stáva popredným modelom metabolických porúch sprevádzajúcich obezitu. V skutočnosti existujú modely transgénnej obezity zebrafish a obezity súvisiacej s diétou zverejnené 12,13. Podobne ako myšie modely, aj obezita vyvolaná stravou u zebričky zvýšila hladinu triglyceridov v sére a akumuláciu lipidov v pečeni 12. Krmivá zebričky navyše zvýšili hladinu glukózy nalačno, čo naznačuje intoleranciu glukózy 14. Použitím tu opísaného spôsobu sme ukázali, že 24 hodín pred liečbou metformínom Senzibilizátor inzulínu zvyšuje rýchlosť metabolizmu v reakcii na test liečby inzulínom 5. Zebra sa tak môže ukázať ako ideálny celý zvierací model na objavenie liekov, ktoré zlepšujú citlivosť na inzulín (embryo), a na stanovenie ich účinnosti pri zmierňovaní obezity od inzulínovej rezistencie (dospelí).
Vývoj genetických a diétou indukovaných modelov obezity zebričky, ktoré napodobňujú fenotypy pozorované u obéznych cicavcov, vytvára impulz pre zahájenie úhynu zebričky zameranej na metabolické choroby. K dispozícii sú testy s vysokou priepustnosťou, ktoré plne oceňujú hodnotu modelu zebrafish pre štúdium homeostázy energie. Inovatívne nástroje umožňujúce hodnotenie fagického pohonu pre obrazovky zamerané na príjem energie, zatiaľ čo testy s vysokou priepustnosťou lipidov vedú k štúdiám homeostázy lipidov celého tela 15-17. Test, ktorý tu popisujeme, je vysoko výkonný nástroj na hodnotenie zapojenia génov, zlúčenín alebo ich interakcií do energetického výdaja celého tela.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.