Štúdie syntézy a štruktúrnej mutagenity substituovaných aromatických amínov

Štúdie syntézy a štruktúrnej mutagenity substituovaných aromatických amínov a itrozlúčenín nové stratégie na zníženie mutagenity O 2 R R H 2 Markus Klein

syntézy

Štúdie syntézy a štrukturálnej mutagenity substituovaných aromatických amínov a itrozlúčenín Nové stratégie na zníženie mutagenity Dizertačná práca na získanie doktorandského titulu v prírodných vedách (Dr. rer. Nat.) Na Katedre chémie na Philippsovej univerzite v Marburgu, ktorú predložil Markus Klein z Gronau Marburg/Lahn 2

Časti tejto práce už boli publikované: M. Klein, G. Boche (1999) Regiošpecifická syntéza substituovaných nitrofluorénov a aminofluorénov s väzbou egishi ako kľúčovým krokom, Synthesis 7, 1246-125. M. Klein, U. Voigtmann, T. Haack, L. Erdinger, G. Boche (2) Od mutagénnych po nemutagénne nitroarény: Vplyv objemných alkylových substituentov na mutagénnu aktivitu 4-nitrobifenylu v Salmonella thyphimurium. Časť I. Substituenty orto k nitroskupine a v 2'-polohe, Mut. Res. 467, 55-68. M. Klein, L. Erdinger, G. Boche (2) Od mutagénnych po nemutagénne nitroarény: Vplyv objemných alkylových substituentov na mutagénnu aktivitu nitroaromátov v Salmonella thyphimurium. Časť II. Substituenty ďaleko od nitroskupiny, Mut. Res. 467, 69-82. Prijaté ako dizertačná práca na Katedre chémie Univerzity Philipps v Marburgu dňa: 26.6.2 Prvý recenzent: Druhý recenzent: Prof. Dr. G. Boche prof. Dr. T. Carell Deň ústnej skúšky: 5.7.2

Veľké sú diela Pánove; kto to skúma, toho to baví. Žalm 111, 2

Obsah I.2 Syntézy a experimenty 27 I.2.1 Zariadenie, chemikálie, metódy. 27 I.2.2 4-itrobifenyly a 4-aminobifenyly s alkylovými a CF3 substituentmi. 21 I.2.3 4-itrobifenyly a 4-aminobifenyly s hydroxy/alkoxy substituentmi. 22 I.2.4 4-itrobifenyly a 4-aminobifenyly s dialkylaminoskupinami. 233 I.2.5 Ostatné 4-itrobifenyly a 4-aminobifenyly. 238 I.2.6 2-itrofluorén a 2-aminofluorén. 241 I.2.7 Heteroaromatické zlúčeniny. 25 I.2.8 4-itrostilbén. 257 I.3 Štúdie mutagenity 26 J Bibliografia. 261 III

Zoznam skratiek Obr. Ad AIB Arom ATP AcCo A dba CYP d DC DCC DCM DME DMF dppe dppf dppp EE EtOH h IF HMPTA HMDS MO BS PAH PAPS PE PPA Py QSAR THF TAV TBABr 3 TPPTS TFP UDP Obrázok Adamantyl azobis-izobutyronitril aromatický at acetyl-koenzým A dibenzylidénacetón cytochróm P dni chromatografia na tenkej vrstve dicyklohexylkarbodiimid dichlórmetán dimetoxyetán dimetylformamid, 1,2-bis (difenylfosfino) etán, 1,1'-bis (difenylfosfino) ferocén-hexamóndimetyl-trichlórmetylester kyseliny octovej trifosfamidoctovej kyseliny trifluórmetylester kyseliny octovej Polycyklický aromatický 3'-fosfadenozín-5'-fosfosulfát, ropný éter (4-6 ° C), kyselina polyfosforečná, pyridín Kvantitatívny vzťah medzi štruktúrou a účinkom tetrahydrofurán Typický pracovný návod Tetrabutylamóniumtribromid trisodný 3,3 ', 3' '- fosfantriylbenzénsulfónová kyselina tris (2-furyl) fosfín

Úvod A.3 Ciele a štruktúra tejto práce Medzi mnohými mutagénnymi a karcinogénnymi látkami majú obrovský význam aromatické amíny a itroaromatické látky. Početní zástupcovia týchto tried látok sa vyrábajú a implementujú vo veľkom rozsahu v priemysle, ale tiež sa tvoria počas spaľovacích procesov (nafta, údenie atď.) Alebo pri ohrievaní mäsa, a preto sú rozšírení v životnom prostredí. Vysoký karcinogénny potenciál takýchto zlúčenín je s najväčšou pravdepodobnosťou čiastočne zodpovedný za neustále zvyšovanie rakoviny v industrializovaných krajinách. Vďaka svojmu mechanizmu účinku sú genotoxické a musia sa metabolicky aktivovať (pozri kapitolu B), najmä medzi amino a itroaromatikami existuje vysoká korelácia medzi karcinogenitou a mutagenitou. Priemyselné použitie týchto látok predstavuje potenciálne vysoké riziko pre ľudské zdravie, a preto je čoraz viac obmedzené zákonom. Rakovina močového mechúra spôsobená aromatickými amínmi je uznávanou chorobou z povolania, ktorá sa vyskytuje v posledných 2 rokoch

Zahynulo 8 pracovníkov. 14 Od priemyslu sa preto žiada, aby vyvíjal bezpečnejšie náhrady. Toto je presne bod, od ktorého začína súčasná práca. Akým spôsobom musia byť aromatické amíny a itroaromatické látky zmenené, aby sa znížil ich mutagénny potenciál a tým pádom ich karcinogénne vlastnosti alebo aby sa úplne uhasili? Pomocou modelových látok odvodených od známych karcinogénov, ako je 4-itrobifenyl 1, 4-aminobifenyl 2, 2-itrofluorén 3, 2-aminofluorén 4 a 4-itrostilbén 5, skúmame, ako štrukturálne zmeny vyplývajú z modifikácie funkčnej skupiny, ale predovšetkým zavedením rôznych substituentov (napr. alkylových, CF3, alkoxylových alebo dialkylaminoskupín) o mutagenite základných teliesok. Obrázok 2: Ako ovplyvňujú štrukturálne úpravy mutagenitu? O 2 O 2 O 2 1 3 5 H 2 H 2 2 4 8

Aromatické amíny a itrozlúčeniny tvoria napr. pretože určité bázové sekvencie sa tam vyskytujú častejšie - silnejší karcinogénny potenciál ako tie, ktoré reagujú menej špecificky. V prípade arylamínov, ako je napríklad 2-aminofluorén alebo 4-aminobifenyl, môže byť tvorba nádorov pečene korelovaná s transkripciami GT v prvej báze kodónu 61 v ras protoonkogéne, t. 56 Aj po vzniku aduktu hrá štruktúra naďalej dôležitú úlohu. 4-aminobifenyl a 2-aminofluorén reagujú za vzniku porovnateľných aduktov v myšej pečeni, ale DA adukty 2-aminofluorénu (napr. - (deoxyguanosin-8-yl) -2-aminofluorén 5) indukovali dvakrát toľko nádorov ako zodpovedajúce adukty 4-aminobifenyl (napr. - (deoxyguanozín-8-yl) -4-aminobifenyl 41). 57 Testy mutagenity mnohých amínov a itroaromatických látok v Salmonella typhimurium TA1538 odhalili podobné účinky (pozri kapitolu C). Pri porovnaní indukcie mutácií vytvorenými aduktmi deoxyguanozínu sa zistili významné rozdiely, pokiaľ ide o účinnosť: -Acetylbenzidín> 1-itropyrén

Na stanovenie mutačnej špecificity sa používa Amesov test mutagenity. Z tohto je možné odvodiť, ktoré bázy sú napadnuté konečným karcinogénom a ktorý typ substitúcií bázových mutácií je mutagénmi indukovaný. Takéto vyšetrovania sa uskutočňujú oveľa jednoduchšie ako pri klasických metódach analýzy aduktov. V porovnaní so štandardnými testovacími kmeňmi TA98 a TA1 a niektorými z ich variantov (TA98R, TA98/1.8DP 6) sa nové špeciálne kmene doteraz používali iba v relatívne malom množstve štúdií a porovnania sú preto ťažko možné. Prehľad nedávneho pokroku vo vývoji nových kmeňov Ames poskytuje Josephy. 71 V tejto práci boli použité štandardné testovacie kmene TA1 a TA98 s metabolickou aktiváciou alebo bez nej. Niektoré látky sa tiež skúmali pomocou TA98R. C.3 Implementácia Spoločnosť Ames vyvinula štandardizovaný pracovný postup, ktorý je stručne uvedený nižšie, aby sa zabezpečila čo najvyššia reprodukovateľnosť výsledkov skúšky. Bakteriálne kmene (his-) vyžadujúce histidín sa kultivujú niekoľko hodín v živnom roztoku do určitej hustoty buniek (

Vzťahy medzi štruktúrou a mutagenitou Obr. 17: Vplyv polohy funkčnej skupiny na mutagenitu H 2 H 2 2 65 TA98 + S9: 79 1,5 Rev/nmol 6) Hydrofobicita môže horšie preniknúť do bakteriálnych stien. 39

Vzťahy medzi štruktúrou a mutagenitou chemicky syntetizované hydroxylamíny 79 a 81, ako 77 a 39, sú silnými mutagénmi. Je zrejmé, že nasledujúce kroky - t. J. Esterifikácia skupiny OH a reakcia s DA - sú oveľa menej náchylné na stérické faktory. Obr. 21: Príčiny inaktivity 1-aftylamínu a 2-aminobifenylu H 2 HOH H 2 P 45 HOH 6 77 78 79 mutagénne mutagénne nemutagénne mutagénne H 2 HOH H 2 HOH P 45 2 39 8 81 mutagénne mutagénne nemutagénne mutagénne A Ďalším štrukturálnym znakom, ktorý kvalitatívne koreluje s mutagénnym potenciálom a ktorý sa dá najlepšie interpretovať ako stérický jav, je stupeň aromaticity látky a súvisiaca rovinnosť. Po Hirayame je 2-itropyrén 82 významne aktívnejší v TA98 ako v TA1, a teda pôsobí primárne ako mutagén s posunom rámca. 95 Obr. 22: Vplyv plošnosti na mutagenicitu (TA98) ii 82 83 TA98-S9: 2569 Rev/nmol 37,7 Rev/nmol Postupnou hydrogenáciou bočných dvojitých väzieb na 2-itro-4,5-dihydropyrén a ďalej na 2- itro-4,5,9,1-tetrahydropyren 83 ide do rovinnosti a súčasne tiež i Tu dochádza iba k oxidácii kruhu. ii Geometria štruktúr bola optimalizovaná pomocou Chem3D pomocou metódy AM1. 41

Vzťahy medzi štruktúrou a mutagenitou Tabuľka 7: Prehľad modelových látok Séria testov Skratka Štruktúra R 3 1-I 4-itrobifenyl 4 4Bp 1 2 R -O 2 4-Aminobifenyl 4ABp 2 1 '-H 2 4-itrosobifenyl 4OBp 89 1 4' 2 '3' -O 4-Hydroxylaminobifenyl 4HOHBp 9-HOH, -dimetyl-4-aminobifenyl, -DiMe-4ABp 91-Me 2-terc-butyl-4-aminobifenyl-tbu-4abp 92 -HtBu-Acetyl-4-aminobifenyl - Ac-4ABp 93-HOAc 3 2-I 4-itrobifenyl 4 4Bp 1 2 O 2 -H 4'-metyl-4-nitrobifenyl 4'Me-4Bp 94 1 '-Me 4'-etyl-4-nitrobifenyl 4'Et -4Bp 95 R 4 '1 2' 3 '-Et 4'-izopropyl-4-nitrobifenyl 4'iPr-4Bp 96 -ipr 4'-terc-butyl-4-nitrobifenyl 4'tBu-4Bp 97 -tbu 4 '-n-Butyl-4-nitrobifenyl 4'nBu-4Bp 98-nbu 3 2-II 3'-Metyl-4-nitrobifenyl 3-Me-4Bp 4 99 02 -H/-Me R 3', 5'- Dimetyl-4-nitrobifenyl 3 ', 5'DiMe-4Bp 1 1' -Me 3 ', 5'-di-terc-butyl-4-nitrobifenyl 3', 5'DitBu-4Bp 11 2 1 4 '2' 3 ' R-tbu 4 2-III 4'-Adamantyl-4-nitrobifenyl O 4'Ad-4Bp 12 2-Ad 4-itroterfenylén 4 '4Tp 13-Ph 2-fenyl-5-nitropyridín 2Ph5P 2 14 -H 4'-terc -Butyl-2 -fenyl-5-nitropyridín 4'tBu-2Ph5P15R4'5O2R-tbu3 2-itro-5-fenylpyridín 4 5Ph2P16O2-H 4'-terc-butyl-2-nitro-5-fenylpyridín 4'tBu-5Ph2P 17 5 1 'R 4' 2 '3' 2-VI 2-itrofluorén 2F 3 7 2 -H 2-tbu 7-metyl-2-nitrofluorén 7Me-2F 18-Me 7-terc-butyl- 2-nitrofluorén 7t Bu-2F 19 -tbu 7-adamantyl-2-nitrofluorén 7Ad-2F 11 -Ad RO 2 5

Syntéza modelových látok Tabuľka 9: Výsledky krížových väzieb s CF3 -substituovanými 4-itrobifenylmi F Metóda vstupu Produkt 3 C O 2 Výťažok b 1 Suzuki a 4'CF 3-4Bp 126

Hydroxylamino> amino> itro z. Dimetylácia amínovej funkcie znižuje mutagenicitu v porovnaní s voľným amínom iba mierne, pretože metylové skupiny sa ľahko štiepia oxidáciou. Terc-butylácia alebo acetylácia aminoskupiny vedie k menej mutagénnym zlúčeninám (92, 93), ale tento účinok nie je dostatočný na úplné potlačenie mutagenity. 14

Výsledky a diskusia o štúdiách mutagenity F.2.1.2 Väčšie alkylové substituenty Či je možné takéto zníženie mutagenity preniesť aj do iných systémov s orto-alkylovými skupinami, a teda všeobecne platný vzťah medzi štruktúrou a mutagenitou sme podrobne preskúmali v našej pracovnej skupine. Schmitt má 1-alkyl-2-aminonaftalény (1-alkyl-2A) 6, 38-311, 1-alkyl-2-aminofluorény (1-alkyl-AF) 4, 312-315 a 3-alkyl-4-aminobifenyly ( 3 Alkyl-4ABp) 2, 316 - 319 syntetizovaný a uskutočnené Amesove testy. 26 Zodpovedajúce štúdie o 3,5-dialkyl-4-aminobifenyloch 32-322 (3,5DiAlkyl-4ABp) pochádzajú z Glende 151 (tabuľka 26). Pre komparatívnu analýzu bol mutagénny potenciál u revertantov/(1 nmol) opäť vypočítaný na základe vašich údajov regresnou analýzou podľa metódy popísanej v C.5. Sú uvedené iba údaje, ktoré boli získané v prítomnosti S9-Mix, pretože väčšina amínov bola neaktívna bez S9-Mix, ako sa očakávalo. Obrázok 82: Orto-alkylované 2-aminonaftalény, 2-aminofluorény a 4-aminobifenyly Et ipr nbu tbu H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 6 38 39 31 311 Et ipr nbu tbu H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 4 312 313 314 315 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 Et ipr nbu tbu 2 316 317 318 319 Me H 2 Et H 2 ipr H 2 Me Et ipr 32 321 322 18

Výsledky a diskusia o štúdiách mutagenity Tabuľka 27: Prehľad mutagenity orto-alkylovaných 4-itrobifenylov Zlúčenina F.2.1.3 Revertanty/(1 nmol) TA98-S9 TA98 + S9 TA1-S9 TA1 + S9 4Bp 1 8,53-1,31- 3Me-4Bp 323 4,64-24,3-3Et-4Bp 324,51-13,71-3iPr-4Bp 325,43-4,12-3tBu-4Bp 326 69). Takéto itro usporiadania sú známe z kryštálových štruktúr orto-alkylovaných itrozlúčenín. 112

1% Ak má štruktúra základného tela taký jasný vplyv na pomer konformácií DA, možno predpokladať, že podobný vplyv majú aj substituenty, ktoré menia tvar molekuly. Najmä pri aduktoch s veľkým 134

Výsledky a diskusia o štúdiách mutagenity, keď replikácia vedie k menším alebo dokonca dokonca žiadnym mutáciám, by zlúčeniny ako 4ABp2 a 4'Bu-4ABp 116 mali byť významne menej mutagénne ako planárne molekuly, ako napríklad 2AF4. Stericky náročné substituenty (terc-butyl, adamantyl) môžu tiež zhoršiť dynamickú transformáciu konformácií zvýšením aktivačnej energie pre tento proces nepriaznivými stérickými interakciami. 141