Subkutánna infúzia angiotenzínu II pomocou osmotických púmp indukuje aortálne aneuryzmy v protokole myší.

Zhrnutie

Subkutánna implantácia osmotických púmp ponúka pohodlný prístup k dlhšiemu a dôslednejšiemu poskytovaniu spojenia. Tento prístup sa rozsiahlo využíva na štúdium aneuryziem brušnej a hrudnej aorty u myší.

Úvod

Aneuryzmy aorty vykazujú trvalé zväčšenie lúmenu aorty, čo naznačuje prasknutie a zvyčajne vedie k smrti. Toto ochorenie sa vyskytuje v brušnej a hrudnej aortálnej oblasti, ktoré sa označujú ako aneuryzmy brušnej aorty (AAA) a aneuryzmy hrudnej aorty (TAA). Z dôvodu neúplného pochopenia molekulárnych mechanizmov a patofyziologických procesov neexistuje dokázaná liečebná terapia, ktorá by zabránila rozšíreniu alebo prasknutiu ktoréhokoľvek typu aneuryzmy aorty. Pretože je ťažké priamo získať vzorky pacientov a vykonávať experimenty na ľuďoch, výskum zameraný na definovanie mechanizmov AAAS sa často extrapoloval zo zvieracích modelov. Bežne používaným zvieracím modelom je subkutánna infúzia angiotenzínu II (AngII) do myší. V porovnaní s inými chirurgickými prístupmi na indukciu AAA u myší, ako je perfúzia intraaortálnej elastázy alebo periaortálna aplikácia chloridu vápenatého, ktoré si vyžadujú laparotómiu 1,2, táto metóda nevyžaduje vstup do telesnej dutiny a vyžaduje minimálnu chirurgickú zručnosť 3,4.

Infúzia AngII u myší vedie k hlbokému rozšíreniu oblasti hrudnej aorty, ktorá sa väčšinou obmedzuje na vzostupnú aortu, ktorá je najbežnejšou oblasťou TAA u ľudí 19,22-26. Podobne ako AAA indukované AngII, TAA indukované počas infúzie AngII tiež rekapitulujú mnoho funkcií ľudských TAA 25. Na rozdiel od AAA indukovaných AngII však TAA indukované AngII nie sú spojené s hypercholesterolémiou a nemajú žiadne rodové rozdiely.

Celkovým cieľom subkutánnej infúzie AngII u myší je štúdium patologických vlastností a molekulárnych mechanizmov AAAS a TAA.

Protokol

Etické vyhlásenie: Štúdie na myšiach sa uskutočňujú so súhlasom Výboru pre inštitucionálnu starostlivosť a použitie zvierat na University of Kentucky (číslo protokolu IACUC: 2006-0009). Po položení sú myši predávkované ketamínovým kokteilom (

1. Výpočet sumy AngII

Poznámka: Tento protokol je založený na príklade infúzie AngII (1 000 ng/kg/min) kŕmenej stravou obohatenou o nasýtené mastné kyseliny počas 4 týždňov u 4 samcov myší LDL receptorov /.

  1. Pred výpočtom množstva AngII potrebného na infúziu sa odvážte študovať myši.
  2. Použite šablónu (Tabuľka 1) na výpočet hmotnosti AngII potrebnej na experiment. V pokynoch na použitie čerpadiel použite „Priemernú rýchlosť čerpania“ ako „Rýchlosť čerpania“ uvedenú v kroku 4 šablóny. V šablóne zaznamenajte kroky 1 - 5 manuálne a kroky 6 - 10 sa počítajú automaticky.
    1. Za predpokladu, že myši dostanú 1 g telesnej hmotnosti počas infúzie 1 000 ng AngII/kg/min počas 4 týždňov.
      POZNÁMKA: Každá myš má veľmi odlišné prírastky telesnej hmotnosti, ktoré závisia od mnohých premenných, ako napríklad kmeň myší a strava. Na základe našich vlastných skúseností z predchádzajúcich štúdií bežne používame „0“ alebo „1 g“.
    2. Vypočítajte celkový objem roztoku AngII 300 μl pre každú myš, pretože každá pumpa vyžaduje približne 250 μl.

2. Rozpustenie AngII

  1. Lyofilizované injekčné liekovky s AngII skladujte pri -20 ° C. Injekčné liekovky s AngII pred otvorením ekvilibrujte na izbovú teplotu.
  2. Odvážte vypočítanú hmotnosť AngII (7,3 mg, ako v Tabuľka 1) v sterilnej plastovej tube.
    POZNÁMKA: Podľa Merckovho indexu nepoužívajte na rozpúšťanie sklenené skúmavky, pretože vodný roztok AngII má silnú afinitu na viazanie na sklo.
  3. Pridajte vypočítaný objem sterilného soľného roztoku (1 200 μl) do plastovej skúmavky obsahujúcej lyofilizovaný AngII, viečko a miešajte inverzne, kým nie je roztok číry.
  4. Označte čísla myší # 1, # 2, # 3 a # 4 na jednotlivých sterilných plastových skúmavkách s uzávermi (0,5 - 1,5 ml). Pripravte roztok AngII pod laminárnou kapotou pre každú myš na základe telesnej hmotnosti, ako v kroku 1.2 a Tabuľka 1 vypočítaná.
    1. Napipetujte napríklad 3,6 μl sterilného soľného roztoku do skúmavky č. 1, potom 296,4 μl roztoku AngII a jemne pipetujte hore a dole.
  5. Označte čísla myší na plastových skúmavkách uzávermi (4 ml, sterilné). Tieto sa použijú na inkubáciu púmp, ako je opísané v kroku 3.13.

3. plnenie osmotického čerpadla

7. Zúčastnite sa zobrazovania aorty tvárou v tvár

  1. Aortu pozdĺžne prerežte cez vonkajšie a vnútorné zakrivenie aortálneho oblúka a rozrežte hlavné vetvy vrátane innominátu, ľavej krčnej tepny a ľavej klavikulárnej artérie. Pin aortu naplocho s vonkajšou adventívnou pokládkou vedľa čierneho vosku.
  2. Získajte obraz tváre aorty intimy pri rovnakom zväčšení. Zahrňte do každého obrázka pravítko na kalibráciu, ako je uvedené v 4.

Reprezentatívne výsledky

4 myšie samce LDL receptor/myši opísané v protokole boli usmrtené po 4 týždňoch infúzie AngII. Aorty sa zozbierali, vyčistili a zobrazili na vizualizáciu aortálnych dilatácií. Ako v Obrázok 3, aorty majú rôzne vlastnosti vrátane rozšírenia oblasti nadobličiek (AAA; 3A), rozšírenie lezeckej oblasti (TAA; 3B) alebo rozšírenie oboch oblastí (prítomnosť oboch AAA a TAA, Obr 3C), zatiaľ čo morfológia u myši bola zhruba normálna (3D). Dilatácia brušnej aorty sa kvantifikuje meraním maximálnej šírky oblasti nadobličiek ex vivo, ako je naznačené červenou čiarou. v 3A. Na meranie stúpajúcej aortálnej dilatácie sa aorty rozrezali a zaznamenali, ako v príklade Obrázok 4. Intimálny povrch bol meraný červenými čiarami vo vzostupnej aortálnej oblasti (oblasť obklopená th v 4A) na vyčíslenie TAA. Odvtedy je na každom obrázku zahrnuté pravítko, ktoré štandardizuje merania v dve postavy 3 a 4.

osmotických
. Obrázok 1. Reprezentatívny obraz naplnenej osmotickej pumpy Každé čerpadlo obsahuje dve časti: hlavné teleso a moderátor prietoku. Po naplnení tela čerpadla AngII sa zavedie moderátor prietoku, ktorý utesní čerpadlo.

osmotických
Obrázok 2. Proces operácie implantátu pumpy (A) Myš je umiestnená v laminárnom kryte s nosovým kužeľom, ktorý neustále uvoľňuje izoflurán a kyslík zhromaždili. (B) Do rezu sa vloží rovný hemostat, aby sa vytvoril podkožný tunel; (C) Pumpa je jemná cez zavedený rez kože; (D) Po zavedení pumpy je kožný rez zošitý.

infúzia
Obrázok 3 Aortálne obrázky (ex vivo) myší infúzovaných AngII AngII 1 000 ng/kg/min sa infúzilo do mužského LDL receptora -./- myši 28 dní. (A) AAA sprevádzané trombózou; Červená čiara (2,05 mm) zobrazuje meranie maximálnej šírky aorty v oblasti nadobličiek. (B) vzostupná aortálna dilatácia (TAA) so zhruba normálnou brušnou aortou; (C) Hlboké dilatácie vo vzostupnej aj nadobličkovej aortálnej oblasti (TAA a AAA); (D) úplne normálna aorta bez zjavného zväčšenia stúpajúcej alebo nadobličkovej aortálnej oblasti.

4.jpg "/>Obrázok 4. Obličejové obrázky hrudných aortálnych oblastí z myší infikovaných AngII AngII 1 000 ng/kg/min sa infundovalo do mužských LDL receptorov vylúhovaný. -/- myši po dobu 28 dní. Plocha ohraničená červenou čiarou predstavuje vzostupnú aortálnu oblasť vrátane časti aortálneho oblúka.

1 Potrebná dávka 1 000 ng/kg/min
2 Začnite telesnú hmotnosť (najväčšia myš) 24.8 G
3 Odhadovaný celkový prírastok telesnej hmotnosti 1 G
4 Čerpacia rýchlosť 0,25 ul/hod
5 Počet myší 4
6. Dávka pre zviera za hodinu 1518 ng
7. Vyžaduje sa konc 6072 ng/ul
8. Pre 300 μl roztoku 1,82 mg/300 p
POTREBA RIEŠENIA
9 Celkový AngII (mg) 7.3 mg
10 Rozpustený vo fyziologickom roztoku a # 160; 1 200 ul
myš telesná hmotnosť Faktor riedenia Objem (ul) Hmotnosť čerpadla (g) Naplnený pomer
# (G) AngII Slané Prázdny Naplnené (%)
1 24.5 1.0 296,4 3.6 1,1443 1,3877 99
2 23.0 0,9 278,2 21.8 1,1677 1,4145 100
3 24.8 1.0 300,0 0,0 1,1438 1,3904 100
4 21.8 0,9 263,7 36.3 1,1438 1,3904 100
Faktor riedenia = telesná hmotnosť myši/najväčšia telesná hmotnosť myši
myš telesná hmotnosť Faktor riedenia Objem (ul) Hmotnosť čerpadla (g) Naplnený pomer
# (G) AngII Slané Prázdny Naplnené (%)
1 24.5 1.0 296,4 3.6 1,1443 1,3877 99
2 23.0 0,9 278,2 21.8 1,1677 1,4145 100
3 24.8 1.0 300,0 0,0 1,1438 1,3904 100
4 21.8 0,9 263,7 36.3 1,1438 1,3904 100

Tabuľka 1: Výpočet pre 28-dňovú infúziu pomocou osmotických púmp.

Diskusia

Osmotické pumpy dodávajúce AngII subkutánne sú rutinným prístupom k indukcii aortálnych aneuryziem u myší. Na základe údajov z mnohých laboratórií nepretržité výsledky ukazujú, že ide o spoľahlivú a reprodukovateľnú metódu na vyšetrenie AAA 3,4 aj TAA 22-26 u myší. Preto sa tento model myši používa ako model, ktorý rekapituluje niekoľko funkcií aneuryzmy ľudskej aorty a poskytuje mechanický prehľad o týchto ničivých chorobách.

Zatiaľ čo starnutie je rizikovým faktorom pre AAA u ľudí, nebolo systematicky študované pre AAA indukované AngII u myší. Zdá sa však, že frekvencia a závažnosť AngII-indukovaných AAA sú podobné u myší vo veku 8 až 48 týždňov 4,5,7. V súčasnosti existuje iba niekoľko štúdií o AngII-indukovaných TAA u myší vo veku 8 až 24 týždňov 22 až 26, ktoré nepreukázali zjavné rozdiely súvisiace s vekom pri tvorbe TAA.

Stručne povedané, infúzia AngII sa dosahuje subkutánnou implantáciou osmotickými pumpami na indukciu aortálnych aneuryziem u myší. Táto metóda dodáva AngII nepretržite definovanou rýchlosťou po určité časové obdobia, ktoré sa používajú na štúdium AAA aj TAA.

Zverejnenie

Publikáciu tohto článku sponzoruje Alzet.