Synevo Moldavsko vírus C-genotypizácie vírusu hepatitídy
Všeobecné informácie a odporúčania
Rovnako ako iné RNA vírusy, aj HCV má na nukleotidovej úrovni značnú genetickú diverzitu generovanú vysokou rýchlosťou vírusových mutácií. Kvôli určitej štruktúre tejto genetickej diverzity bola klasifikácia HCV formulovaná do 6 genotypov (nazývaných 1, 2, 3, 4, 5, 6) na základe fylogenetickej analýzy genómovej sekvencie. Každý genotyp je zase fylogeneticky rozdelený do jedného alebo viacerých podtypov (nazývaných a, b, c atď.). Tieto názvy sa stali štandardným systémom pre novú nomenklatúru genotypov HCV 10; 11. Ľudia infikovaní HCV navyše cirkulujú a správajú sa ako zmes odlišných vírusových populácií nazývaných kvázi druhy.
6 hlavných genetických typov sa navzájom líši v nukleotidových sekvenciách v pomere 30 - 35%; medzi podtypmi je rozdiel 20 - 25% a v rámci toho istého podtypu rozdiel až 10%.
Genóm HCV je tvorený doménami, ktoré sa veľmi líšia rýchlosťou mutácií a variabilitou nukleotidových sekvencií. Neprekladaná oblasť na 5 'konci genómu (5'UTR) je teda najzachovalejšou doménou s najpomalšou evolučnou rýchlosťou. Potom nasleduje C (jadro) gén, ktorý kóduje nukleokapsidové jadro proteínu a ktorý sa vyvíja trikrát rýchlejšie v porovnaní s oblasťou 5'UTR. Gény kódujúce obalové proteíny E1 a E2 tvoria hypervariabilnú oblasť, ktorá sa líši od jedného izolátu k druhému. Toto umožňuje vírusu obísť imunitné mechanizmy hostiteľa namierené proti prístupným proteínom vo vírusovom obale.
Genotypy a podtypy HCV predstavujú zložité vzorce geografického rozloženia, relatívnej prevalencie a spôsobov prenosu infekcie, ktoré možno lepšie pochopiť, ak sú rozdelené do troch skupín:
1. Epidemická skupina obsahuje podtypy 1a, 1b, 2a, 2b a 3a, ktoré majú globálnu distribúciu a sú zodpovedné za väčšinu infekcií na celom svete. Rýchle globálne šírenie týchto podtypov je výsledkom ich efektívneho prenosu cez infikované krvné produkty a podávania intravenóznych liekov. Podtypy 1b a 2a sú spojené predovšetkým s prenosom krvnými produktmi a ich relatívna prevalencia sa v posledných rokoch znížila v dôsledku zlepšeného skríningu darcov. Podtypy 1a a 3a sa vyskytujú hlavne u drogovo závislých a ich prevalencia stúpa.
2. endemická skupina má nižšiu distribúciu ako epidemická skupina obmedzená na určité regióny. Napríklad podtypy genotypu 6 sa nachádzajú iba v juhovýchodnej Ázii. Veľmi vysoká genetická diverzita endemických kmeňov naznačuje dlhodobé pretrvávanie infekcie v týchto regiónoch z dôvodu zachovania relatívne neefektívnych spôsobov prenosu vrátane sexuálneho prenosu.
3. Miestna epidemická skupina má vysokú prevalenciu v určitých regiónoch a populáciách na celom svete. Podtyp 4a je teda zodpovedný za infikovanie viac ako 10% egyptskej populácie a zriedka sa vyskytuje mimo Blízkeho východu. Epidemiologické štúdie naznačujú, že k tomuto javu došlo v priebehu dvadsiateho storočia, počas hromadného intravenózneho podávania liekov proti schistosomiáze 11 .
U nás prevláda genotyp 1b a zmes genotypov 1a a 1b 4. Nedávna štúdia uskutočnená na inštitúte Matei Bals v Bukurešti na 670 pacientoch naznačila 99,7% prevalenciu HCV genotypu 1 6 .
Znalosti o vírusovom genotype poskytujú prognostické informácie o účinnosti liečby u pacientov s chronickou vírusovou hepatitídou HCV. Napríklad genotyp 1b (najčastejšie získaný po transfúzii) je spojený so zlou reakciou na liečbu a zvýšeným rizikom cirhózy a hepatocelulárneho karcinómu. Na druhej strane, genotypy 2 a 3 (získané prevažne užívaním drog i.v.) sú spojené s priaznivou odpoveďou na antivírusovú liečbu 7; 8; 9 .
Americký Národný inštitút zdravia (NIH) v roku 2002 ukázal, že stanovenie genotypov HCV je dôležité pri výbere optimálnych dávok interferónu a ribavirínu, ako aj trvania liečby. U pacientov s divokým typom genotypu 1 sa preto odporúča trvanie liečby 48 týždňov a u pacientov s genotypom 2 a 3 trvanie 24 týždňov s nižšími dávkami ribavirínu. Je užitočné vykonať genotypizáciu HCV pri všetkých infekciách vírusom C pred začatím akejkoľvek liečby 1 .
Test vykonaný v našom laboratóriu využíva techniku PCR na amplifikáciu niektorých oblastí genómu HCV, po ktorej nasleduje reverzná hybridizácia na identifikáciu genotypov HCV 1 až 6 a podtypov a a b genotypu 1 5 .
Oblasť 5'UTR predstavuje viac sekvencií špecifických pre každý genotyp distribuovaných pozdĺž 7 malých variabilných oblastí, ktoré môžu poskytnúť presné informácie o genotypoch 1-5 a podtypoch a a b genotypu 6. Kvôli veľkej sekvenčnej podobnosti subklipy cl genotypu 6 ( predtým klasifikované ako 7, 8, 9 a 11) nemožno odlíšiť od genotypu 1 iba analýzou oblasti 5'UTR. Presnosť identifikácie podtypov 1a a 1b analýzou oblasti 5'UTR je medzi 80% a 95% a závisí od konkrétnych testovaných izolátov 3. Náš test používa sekvencie jadrovej oblasti v spojení s oblasťou 5'UTR na identifikáciu podtypov genotypu 6, c-1. Na zlepšenie presnosti identifikácie podtypu la a lb sú zahrnuté ďalšie génové sekvencie jadra 5. .
Výcvik pacientov - nie je potrebné žiadne špeciálne školenie 5 .
Odobratý exemplár - krv príde 5 .
Zberová nádoba - vacutainer obsahujúci EDTA ako antikoagulant 5 .
Zozbierané množstvo - toľko, koľko umožňuje vákuum 5 .
Dôvody zamietnutia skúsiť - použitie heparínu ako antikoagulancia; zrážané alebo hemolyzované vzorky 5 .
Vyskúšajte stabilitu - Krv EDTA je stabilná 48 hodín pri 2 - 8 ° C 5 .
Metóda - reťazová polymerizačná reakcia nasledovaná reverznou hybridizáciou; biotinylovaný amplifikačný produkt prechádza hybridizačným procesom s použitím oligonukleotidových sond špecifických pre 5'UTR a základné oblasti rôznych genotypov HCV pripojených k nitrocelulózovému prúžku; po kroku hybridizácie sa pridá konjugát (streptavidín značený alkalickou fosfatázou), ktorý sa pripojí k biotinylovanému hybridu; pridaný chromogénny substrát bude nakoniec reagovať s alkalickým komplexom strepatvidín-fosfatázy a bude vytvárať hnedo-fialovú zrazeninu, ktorá sa vizualizuje ako pásové pásy; interpretácia výsledkov sa vykonáva pomocou karty 5 .
Limity a interferencie
Genotypovanie HCV sa neodporúča na skríning alebo potvrdenie infekcie HCV. Test je možný iba v prípade virémie C> 600 IU/ml.
V niektorých prípadoch možno dosiahnuť neinterpretovateľné výsledky z dôvodu heterogenity sekvencií genómu HCV, zmiešaných infekcií alebo (zriedkavej) existencie rekombinantných kmeňov HCV 5 .
1. Praktické pokyny AASLD http: /www.aasld.org/pdffiles/Prac._Guide_Hep_C
2. Konsenzusová konferencia Liečba hepatitídy C. Maison de la Chimie, Paríž, Francúzsko, 27. - 28. februára 2002. Agence Nationale d ”Accreditation et d” Evaluation en Sante (ANAES).
3. Chen Z, Weck KE. Genotypizácia vírusu hepatitídy C: vyšetrovanie 5 'nepreloženej oblasti nemôže presne rozlíšiť genotypy 1a a 1b. In J Clin Microbiol. 2002; 40: 3127-3344.
4. Ileana Constantinescu, Klinický inštitút Fundeni. Genotypizácia vírusov hepatitídy v Rumunsku. Sympózium jún 2008, Tg. Mures: Úloha techník molekulárnej biológie pri objasňovaní mechanizmov infekcie vírusom hepatitídy C, ako aj pri objavovaní nových markerov fibrózy a hepatocelulárneho karcinómu spojených s touto infekciou.
. 5. Laboratórium Synevo. Konkrétne odkazy na použitú technológiu práce. 2009. Typ odkazu: katalóg.
6. Neaga Emil. Prevalencia HCV genotypu 1 v Rumunsku. Sympózium jún 2008, Tg. Mures: Úloha techník molekulárnej biológie pri objasňovaní mechanizmov infekcie vírusom hepatitídy C, ako aj pri objavovaní nových markerov fibrózy a hepatocelulárneho karcinómu spojených s touto infekciou.
7. Nguyen MH, Keeffe EB. Prevalencia a liečba genotypov vírusu hepatitídy C 4,5 a 6. In Clin Gastroenterol Hepatol. 2005; 10: S97 - S101.
8. Pawlotsky JM. Genetická variabilita vírusu hepatitídy C: patogénne a klinické dôsledky. In Clin Liver Dis. 2003; 7; 45 - 66.
9. Seeff LB, Hoofnagle JH Príloha: Konferencia Národného ústavu zdravotného konsenzu o rozvoji: Manažment hepatitídy C 2002. In Clin Liver Dis. 2003; 7: 261-287.
10. Simmonds P, Bukh J, Combet C a kol. Konsenzuálne návrhy jednotného systému nomenklatúry genotypov vírusu hepatitídy C. V Hepatol. 2005; 42; 962 - 973.