TreadWheel Interval Training Protocol pre jemne indukované cvičenie v Drosophila melanogaster

Zhrnutie

TreadWheel využíva rotačný pohyb na jemné navodenie cvičenia u dospelých Drosophila melanogaster využitím výhody vrodenej negatívnej geotaxie. Umožňuje analýzu interakcií medzi cvičením a faktormi, ako je genotyp, pohlavie a strava, a ich účinkami na fyziologické a molekulárne testy na hodnotenie metabolického zdravia.

Abstrakt

Úvod

Epidémie obezity u detí a dospelých rastú v kultúrach, ktoré konzumujú vysoko kalorické diéty a zostávajú dlho neaktívne, čo môže viesť k vážnym dlhodobým účinkom vrátane inzulínovej rezistencie, chronických zápalov a osteoartritídy 1, 2, 3, 4. Prevalencia týchto porúch naďalej stúpa v dôsledku rastúcej nerovnováhy v príjme a výdaji kalórií, ktorá sa pripisuje zvýšenej konzumácii tukov a cukrov a prevažne sedavému životnému štýlu 5. Preto táto energetická nerovnováha viedla k zvýšeniu výskytu diabetes mellitus 2. typu (T2DM) a kardiovaskulárnych chorôb (CVD) 5. Jedinci majú väčšie riziko vzniku oboch porúch, ak im bol diagnostikovaný symptómy metabolického syndrómu (MetS), brušnej obezity a dyslipidémie 2. MetS je formovaný komplexnými interakciami medzi genotypom a rôznymi faktormi životného prostredia, ako je strava a cvičenie 6. Aby ste úplne pochopili základné mechanizmy tejto zložitej choroby, zvážte všetky tieto faktory.

Pokiaľ ide o boj proti MetS, lekári najskôr odporúčajú podstúpiť zmeny životného štýlu, ktoré zahŕňajú zdravú a vyváženú stravu a fyzickú aktivitu 2, 7, 8. Pretože účinné lieky sú obmedzené a operácia bypassu žalúdka je nákladná a vyžaduje si celoživotný lekársky dohľad, odporúčajú sa farmakologické a chirurgické zákroky iba v závažných prípadoch a iba v spojení s týmito zmenami životného štýlu 3, 7, 8. Počas zásahov do životného štýlu, ako napr B. Cvičenie a strava, ktoré umožňujú produkovať a udržiavať dlhodobé ciele chudnutia, bez ohľadu na to, či tieto nápravné opatrenia môžu alebo nemôžu úplne zmierniť negatívne účinky spojené s MetS, si vyžadujú ďalšie štúdium 7, 8 .

Na štúdium účinkov cvičenia na metabolické poruchy sa už roky používajú myšacie modely; zavedenie výskumných cvičení zameraných na lietanie na MetS je však relatívne novým úsilím 9, 10, 11, 12. Muchy sú dokonalým prostriedkom na štúdium cvičenia v kontrolovanom laboratórnom prostredí, pretože sú ľahko manipulovateľné, majú krátku životnosť, sú nenáročné na údržbu a energetické metabolické cesty sú medzi Drosophilou a ľuďmi veľmi zachované 13. Genómy D. Melanogaster sú dobre charakterizované a existuje veľké množstvo genetických nástrojov na použitie v Drosophile, ktoré poskytujú prehľad o rôznych genotypoch a interakciách medzi genotypmi a prostrediami, ktoré by mohli modulovať účinky cvičenia na zdravie organizmu 14 .

Aby sme jemne navodili cvičenie v Drosophile, vyvinuli sme cvičebný stroj s názvom TreadWheel (obrázok 1). TreadWheel je (ďalej len TW) rotačný pohyb, ktorý spúšťa vrodenú negatívnu tendenciu geotaxie pôsobením gravitácie na vrch injekčnej liekovky, čo následne stimuluje lezenie do mušky, aby sa neustále predefinovalo. Na rozdiel od iných metód je krútivý pohyb TW vo svojej podstate jemný, čo minimalizuje počet ďalších stresových faktorov, ktoré môžu vzniknúť a ovplyvniť výsledky. Cvičenie, pri ktorom sa strojom indukuje veľký počet múch bez stresu, teda umožňuje študovať účinky cvičenia na metabolické zdravie (obrázok 2)), Starnutie, spánok a mnoho ďalších tém 11 umožní.

Naša metóda sa riadi inverzným pyramidálnym intervalovým tréningovým protokolom, ktorý obsahuje hlavne aspekty aeróbneho intervalového tréningu (AIT) s vytrvalostným fyzickým tréningom. V tomto protokole sa mení štandardný režim AIT, čím sa zvyšuje trvanie každého intervalu počas päťdňového obdobia, aby sa podporila vytrvalosť. AIT je obzvlášť nápomocný pri prevencii MetS v porovnaní s inými intervenčnými modalitami a bol účinnejší pri zvrátení bežných rizikových faktorov metabolického syndrómu ako nepretržité mierne cvičenie 19, 20. Nevýhodou TW vo vzťahu k Power Tower je však to, že si mušky zvykajú rýchlejšie na rotačný pohyb, takže variácia vrodenej tendencie zvyknúť si na mušky môže sťažiť interpretáciu výhod cvičenia. Elegantné riešenie tohto obmedzenia opisujú Watanabe a Riddle 15 a ich doplnkový článok 21.

Protokol

1. Nastavenie a prevádzka TreadWheel

Poznámka: Pozri doplnkový obrázok 1 pre schémy zapojenia na cvičení TW Maschinenbau. Požadované časti sú v Tabuľka materiálovuvedené. Frázy „TW“, „TreadWheel“, „výcvikové zariadenie“ a „stroj“ sú v protokole použité zameniteľné.

1. Kalibrujte motor s vypínačom tak, aby doba rotácie bola 15 s (4 ot/min). Rýchlosť stroja pred injekčnými liekovkami pripevnenými v zaistených svorkách na kalibráciu rotujúcich ramien.
   1. Rýchlosť nastavujte pomocou štandardných stopiek a nepohyblivého predmetu dočasne pripevneného k stroju, ako napríklad malá kefa s páskou pripevnenou k krytu motora, pričom sa kefa dotýka otočnej konzoly. Načasujte počet otáčok za minútu s nehnuteľným predmetom ako referenčným bodom a upravte rýchlosť tak, aby ste dosiahli periódu rotácie 15 s (4 ot./min.).

2. Zachytávanie a údržba mušiek

Poznámka: O všetky mušky je postarané v inkubátore pri 25 ° C s 50% vlhkosťou a 12 h cyklom svetlo/tma medzi opísanými manipuláciami na stolnom počítači. Pokiaľ nie je uvedené inak, muchy sa kŕmia štandardnou syridlovou stravou z melasy z kukuričnej múky.

1. Pripravte každý genotyp s taniermi na agar s jablkovým džúsom na kladenie komôr, jednou kvapkou kvasnicovej pasty na tanier a 6 uncami plastových fliaš na zber vajíčok, v ktorých sa nachádzajú larvy.
   1. Pripravte si misky s agarom s jablkovým džúsom, naplňte Petriho misky do ¾ plného 35 x 10 mm, rozpustené 3% agarom v zakúpenom jablkovom džúse. Stuhnuté pláty skladujte až do použitia v chladničke.
   2. V 50 ml kónickej centrifugačnej skúmavke skombinujte zakúpené suché droždie s destilovanou vodou v pomere 2 ml vody na každý gram kvasníc. Zmiešajte droždie s vodou, aby ste pomocou sklenenej miešacej tyčinky vytvorili pastu s konzistenciou kečupu. Podľa potreby upravte pomery droždia a vody, aby ste dosiahli požadovanú konzistenciu.
   3. Medzi použitiami skladujte kvasnicovú pastu v chladničke. Uvoľnite rúrku uzáveru, aby sa umožnilo odplynenie.
   4. Pomocou ostrej ihly alebo noža vyrazte malé otvory do fliaš so štvorcovým dnom s objemom 6 uncí (polypropylén) ako otvory do pokladníc.
   5. Naneste malé miesto z kvasnicovej pasty (

   Po dni odpočinku po absolvovaní cvičebného protokolu otestujte všeobecný test výkonnosti pri stúpaní pomocou testu rýchlej iteračnej negatívnej geotaxie (RING) negatívneho geotaxového lezenia 22 .
   Skupiny s 10 muchami umiestnite do prázdnych injekčných liekoviek s anestéziou CO2 (alebo poklepte priamo z injekčných liekoviek s jedlom, ak sú už triedené) a utesnite ich parafínovým filmom, aby ste zabránili úniku múch. Dajte muškám aspoň 10 minút, aby si zvykli na nové liekovky. Aby sa fľaša neprevrátila, prelepte lepiacou páskou

   Poznámka: Vzorky, štandardy, štandardný roztok glycerolu a pracovný roztok triglycerolu použité počas testu by sa mali počas protokolu uchovávať na ľade a pokiaľ sa nepoužívajú, mali by sa uchovávať v chladničke.

   Reprezentatívne výsledky

   Nás obzvlášť zaujíma identifikácia faktorov, ktoré prispievajú k celkovému metabolickému zdraviu jednotlivca. Predtým sa zistilo, že interakcia genotypov prostredníctvom stravy významne prispieva k zvyšovaniu úrovne metabolických vlastností populácie 14. To znamená, že každý genotyp reaguje na ekologické rozdiely jedinečným a komplexným spôsobom. S cieľom rozšíriť našu prácu na vplyvoch genotypu a prostredia na fyzické cvičenie sme vyvinuli TreadWheel, ktorý je schopný vysoko výkonným spôsobom detegovať početné genotypy pre aeróbny intervalový tréning (AIT).

   
   
   ilustrácia 1 : Rotoped TreadWheel. (A.) stroj pojme 48 injekčných liekoviek a má funkciu nastaviteľnej rýchlosti. Pokusy sa tu uskutočňovali pri 4 otáčkach za minútu. (B.) Jednotlivé potravinové ampulky s experimentálnymi muškami boli upnuté a na miesto zacvaknutý rotačný hriadeľ. (C.) Vzdialenosť medzi zátkami injekčných liekoviek a potravinami bola 6 cm pre injekčné liekovky na cvičenie a 1 cm pre kontrolné injekčné liekovky. Fľaštičky sa potom umiestnili do počítača na cvičenie. (D.) Na výcvik lietania sa používal päťdňový cvičebný režim s inverznou pyramídou. Každý deň bolo k jednému z cvičebných bojov pridaných ďalších päť minút, aby sa postupne zvýšila intenzita tréningu, vytrvalostné modely, intervalový tréning. Tento údaj bol prevzatý z Mendez et al. upravené 11. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.
   
   
   Obrázok 2 : Optické metódy a reprezentatívne výsledky. (A.) Metódy testovania interakcií s larválnymi stravami a cvičením dospelých. Larvy boli chované na tuky alebo na bežné laboratórne diéty a boli prepnuté do pohybového aparátu na normálnu stravu. Muchy dospelých boli rozdelené podľa pohlavia, umiestnené do experimentálnych skupín a cvičené päť po sebe nasledujúcich dní. Potom bol vykonaný prstencovitý negatívny geotaxický lezecký test a muchy boli zmrazené na meranie triglyceridov. Reprezentatívne údaje o triglyceridoch sa objavujú v dvoch genetických líniách, Oregon R a y 1 w 1 pre (B.) Ženy a muži (C.). Všetky mušky boli odchované na bežnej strave a cvičili v dospelosti. Úrovne s rôznymi písmenami sa výrazne líšia (s. 11. Reprezentatívne údaje o stúpaní pre čiaru DGRP 153 pre (D.) Ženy a muži (E.) sa zobrazí. Každý bod zodpovedá priemernému lezeckému výkonu 232 alebo viac ľudí za tri nezávislé časové body. Chybové pruhy označujú štandardnú chybu. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.
   
   Doplnkový obrázok 1: podrobné schematické znázornenie kolieska TreadWheel. (A.) Schéma liekoviek so svorkou s dvojitou injekčnou liekovkou pripojených k stroju. (B.) Pohľad zvnútra na rotačný pohon stroja. (C.) Paralelný priemet prednej časti stroja. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

   Diskusia

   Ukázalo sa, že podrobne popísaný cvičebný protokol úspešne stimuluje jemný pohyb v Drosophile a dá sa použiť na simuláciu vytrvalostného tréningu v kontrolovanom laboratóriu 11. Je potrebné poznamenať, že pri vývoji konceptu TreadWheel sme pôvodne uvažovali o komerčných produktoch, ktoré by mohli byť upravené tak, aby fungovali podobným spôsobom (napr. Laboratórne grilovanie). Nakoniec sme však tento prístup odmietli, aby sme si vybrali dizajn vyrobený na mieru, pretože komerčné zariadenia nemali dostatočne nízku rýchlosť (4 otáčky za minútu) a chýbali dostatočné možnosti liekoviek na generovanie vzoriek s vysokou priepustnosťou.

   Štúdie s TreadWheel ukázali, že priemerné cvičenie znížilo telesnú hmotnosť, celkové ukladanie triglyceridov a glykogén a zároveň zvýšilo obsah bielkovín a výkon pri lezení 11. Okrem toho existovali rôzne odpovede týkajúce sa pohlavia a genotypov pre telesnú hmotnosť, ako aj triglyceridov, bielkovín, glykogénu, glukózy a úrovní cvičení 11, 15. Aj keď variabilita v reakcii na pohyb a stravu medzi genotypmi a pohlavím môže byť zložitá, môže byť ťažké ju interpretovať a niekedy to odráža zdroje skutočných biologických variácií pozorovaných v prírodných populáciách. V snahe porozumieť rôznym faktorom, ktoré sú základom vysokej miery MetS, vyvinieme nástroje, ktoré uľahčia rozmotanie relatívneho významu rôznych ovplyvňujúcich faktorov testovaním tohto faktora v modelových organizmoch, aby sa vyvinuli personalizované preventívne a liečebné intervencie. Aby bolo možné úplne vyhodnotiť efektívnosť cvičenia, je potrebné pri uskutočňovaní experimentov a vyvodzovaní záverov brať do úvahy každý z týchto faktorov a ich vzájomné pôsobenie.

   Zverejnenie

   Autori nič neprezradili.

   Poďakovanie

   Chceli by sme poďakovať Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laure Mafle, Olivii Fish a zvyšku laboratória Reed za pomoc pri chove a spracovaní obrázkov. Sean Mendez zostrojil originálne TreadWheel pomocou dielne UAB. Táto štúdia bola financovaná Vysokoškolskou akadémiou kreativity a výskumu NIH R01 GM 098856 LKR na University of Alabama KEL a BJW.

   ---