UNIVERZITA CLINIC HAMBURG-EPPENDORF - PDF na stiahnutie zadarmo

UNIVERZITNÝ KLINICKÝ HAMBURG-EPPENDORF Inštitút pre bunkovú a integračnú fyziológiu Centra experimentálnej medicíny Prof. Dr. med. Heimo Ehmke Úloha kináz WNK v regulácii transportu elektrolytov v distálnom nefróne knock-out myši BKβ1 Dizertačná práca Získanie diplomu doktora zubného lekárstva na Lekárskej fakulte Univerzity v Hamburgu prezentovaného Annelen Dittmerovou z Buchholz i.d.n. Hamburg 2013

clinic

Prijaté Lekárskou fakultou Hamburgskej univerzity dňa: 13. mája 2014 Publikované so súhlasom Lekárskej fakulty Hamburgskej univerzity. Skúšobná komisia, predseda: prof. Dr. med. Skúšobná komisia H. Ehmke, druhý recenzent: PD Dr. rer. nat. Skúšobná komisia E. Schwedhelma, tretí recenzent: PD Dr. med. C. Meyer-Schwesinger

Obsah Obsah 1. Úvod 7 1.1 Arteriálna hypertenzia v súvislosti s príjmom sodíka. 7 1.2 Sodné a draselné transportné systémy v obličkách 9 1.3 Gordonov syndróm: Objavenie úlohy WNK kináz v regulácii krvného tlaku. 17 1.4 WNK kinázy.18 1.5 Účinky WNK kináz na rovnováhu elektrolytov. 20 1.6 Cieľ a prístup v práci. 25 2. Materiál a metódy. 27 2.1 Materiál 27 2.1.1 Všeobecné laboratórne vybavenie 27 2.1.2 Spotrebný materiál. 29 2.1.3 Chemikálie. 30 2.1.4 Enzýmy 31 2.1.5 Biochemicals 32 2.1.6 Kit . 33 2.1.7 Roztoky, pufre. 33 2.2 Metódy. 36 2.2.1 Draselná strava zvierat. 36 2.2.2 Ochranné opatrenia na izoláciu RNA. 37 2.2.3 Disekcia obličky a izolácia RNA v obličkovej zóne. 37 2.2.4 Meranie OD izolovanej RNA z obličiek 39 2.2.5 Agilentné meranie izolovanej RNA z obličiek 39 2.2.6 Mikrodisekcia 40 2.2.7 Izolácia RNA nefrónových tubulov. 41 2.2.8 Reverzná transkriptáza (RT). 42 2.2.9 Actin-PCR. 43 4

Obsah 2.2.10 Elektroforéza na agarózovom géle 44 2.2.11 Real-time PCR 44 2.2.12 Štatistika. 49 3. Výsledky 51 3.1 Porovnanie myší knock-out divokého typu a BKβ1 51 3.1.1 Výsledky PCR analýzy kôry v reálnom čase. 51 3.1.2 Výsledky PCR analýzy mikrodisekcie v reálnom čase 55 3.2 Výsledky diéty s obsahom draslíka. 58 3.2.1 Luminálny transportér sodíka NCC a epiteliálny sodíkový kanál ENaCβ na diéte s obsahom draslíka 58 3.2.2 Apikálny kanál na báze draslíka ROMK na diéte s obsahom draslíka 61 3.2.3 WNK kinázy s obsahom draslíka 62 3.2.4 Kináza SGK1 a proteín GRP58 s obsahom draslíka. 64 3.2.5 Proteín CHIF na diéte s obsahom draslíka 66 3.2.6 Transportér NKCC2 na diéte s obsahom draslíka. 67 4. Diskusia 68 4.1 Motivácia otázky 68 4.2 Myši divokého typu na diéte s obsahom draslíka ... 69 4.2.1 Kotransportér chloridu sodného (NCC) 72 4.2.2 Epiteliálny sodíkový kanál (ENaC). 72 4.2.3 Luminálny draslíkový kanál ROMK 73 4.2.4 Správanie kináz 75 4.2.5 Ďalšie možné ciele aldosterónu 79 4.3 Porovnanie myší knock-out divokého typu a BKβ1. 4.3.1 Výsledky PCR v reálnom čase pri normálnej strave 82 4.3.2 Výsledky mikrodisekcie 84 4.4 BKβ1 knock-out myši na draslíkovej diéte ... 85 5

Obsah 4.4.1 Diéta so zníženým obsahom draslíka u BKβ1 knock-out myší. 85 4.4.2 Diéta s vysokým obsahom draslíka u knock-out myší BKβ1 . 88 4.5 Výhľad. 90 5. Zhrnutie 93 6. Zoznam skratiek. 94 7. Zoznam obrázkov. 98 8. Zoznam tabuliek. 101 9. Bibliografia. 102 10. Poďakovanie. 119 11. CV. 120 12. Čestné vyhlásenie . 121 6

Materiál a metódy 2. Materiál a metódy 2.1 Materiál 2.1.1 Všeobecné laboratórne prístroje Tabuľka 1a: Použité všeobecné laboratórne prístroje Označenie typu prístroja Analytická váha spoločnosti ISO 9001 Sartorius AG, Göttingen Autoclave 3850 ELC Tuttnauer Systec Ltd., NY, USA Bioanalyzátor typu 2100 Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA Elektroforézový napájací zdroj EPS 600 Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg Sklenená pipeta Pipetová batéria Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co KG, Eberstadt Elektroforézna komora Polytronový homogenizátor PCR zariadenie Tyristorový regulátor TR50 Gene Amp PCR systém 2400 Janke & Kunkel, IKA-Werke, Wilmington, NJ, USA Perkim Elmer, Norwalk CT, USA ph-meter ph-meter 320 Mettler-Toledo GmbH, Giessen Photometer Ultrospec 3000 Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg Pipettes Pipetman P2, P10, P20, P200, P1000 Gilson, Middleton, WI, USA 27

Materiál a metódy Tabuľka 1b: Použité všeobecné laboratórne vybavenie Typové označenie prístroja Spoločnosť Presná váha 440-33N Gottl. Kern & Sohn GmbH, Balingen - Frommern Zariadenie v reálnom čase PCR Light Cycler gooseneck light KL 1500 LCD Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Schott AG, Mainz Speed ​​Vac Concentrator 5301 Eppendorf AG, Hamburg Thermoblock TB1 Biometra GmbH, Göttingen Thermomixer 5436 Eppendorf AG, Hamburg Tabuľka ultrafialového žiarenia - Biometra GmbH, Göttingen Vortexer MS2 Minishaker Janke & Kunkel, IKA-Werke, Wilmington, NJ, USA Centrifuge Centrifuge 5417C Eppendorf GmbH, Hamburg Centrifuge 5417R Biofuge pico Biofuge stratos Eppendorf GmbH, Hamburg Heraeus Instruments GmbH, Osterode Heraeus Instruments Osterode 28

Materiál a metódy 2.1.2 Spotrebný materiál Tabuľka 2: Použitý spotrebný materiál Materiál Označenie produktu Spoločnosť Outletové pipety Sérologická pipeta 10 ml Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA Pipetovacie špičky Špičky na bezpečné uzavretie: 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl Biozym Biotech Trading GmbH, Viedeň, Rakúsko Mikroreakčné nádoby 1,5 ml Sarstedt AG, Nümbrecht 2 ml Sarstedt AG, Nümbrecht PCR kapiláry v reálnom čase PCR skúmavky 0,2 ml skúmavky Safe-Lock 0,5 ml pre Agilent Light Cycler Capillaries (20 µl) Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Tubes Cellstar 50 ml Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster, Rakúsko Centrifugačné skúmavky Skúmavky 4 ml Sarstedt AG, Nümbrecht 29