Výroba partikulárnych formulácií pre rekombinantné proteíny pomocou fluidného lôžka - PDF
1 dizertačná práca na získanie doktorandského titulu na Fakulte chémie a farmácie Univerzity Ludwiga Maximiliána v Mníchove Výroba časticových formulácií pre rekombinantné proteíny pomocou fluidného lôžka Matthias Ganz z Würzburgu 2007
8 OBSAH 1. Úvod Výroba proteínových častíc Fluidné lôžko Parametre zariadenia Parametre procesu Riadenie sušenia Proteínové sušenie vo fluidnom lôžku Alternatívne postupy výroby proteínových častíc Sušenie rozprašovaním Sušenie mrazom Sušenie sprejom mrazom Precipitácia Superkritické kvapaliny Röntgenová fotoelektrónová spektroskopia vo farmácii Základy Kvalitatívna materiálová analýza prototypov a metódy analýzy prototypov Kvantitatívna analýza X Metódy kvantitatívnej analýzy ľudské interleukínové látky pre procesy vo fluidnom lôžku iné látky 24
9 OBSAH 3.2. Procesné systémy Systém GPCG-1 Systém Mini-Glatt Analytické metódy Charakterizácia rhil SE-HPLC pre analýzu agregátov RP-HPLC pre analýzu príbuzných druhov RP-HPLC pre analýzu oxidovaného metionínu Gélová elektroforéza (strana SDS) Laserová difrakcia Karl-Fischerova polarimetria DSC XPS UV spektroskopia Meranie povrchu BET Výsledky a diskusia Porovnávacie testy v rôznych systémoch Testy v systéme GPCG-1 Testy v systéme Mini-Glatt Zhrnutie Optimalizácia systému Mini-Glatt Spustená tryska Upravená nádoba na materiál a držiak trysky 53
10 OBSAH Ďalej optimalizovaný zásobník materiálu Systém Mini-Glatt s mikro súpravou Zhrnutie stability formulácií rhil-11 Nosné materiály a postrekové roztoky bez stabilizačných prísad Nosné materiály a postrekové roztoky s prísadou trehalózy MCC-Gule a postrekové roztoky s prísadou PS80 Vplyv pridaného cukru v kombinácii s 0,02% PS Zhrnutie XPS produktov rhil-11 Spektrum nosných materiálov, trehalóza a rhil XPS analýza nosičov potiahnutých rhil-11 Loading Výpočet pokrytia na základe XPS analýz Vyhodnotenie modelov Zhrnutie Literatúra 125
11 Skratky BE Väzbová energia BET Brunnauer, Emmet a Teller BSA hovädzí sérový albumín DMSO dimetylsulfoxid DSC diferenčná skenovacia kalorimetria FD fluidizačný tlak FD fluidizačný tlak GPCG-1 Glatt Particle Coater Granulator-1 IR infračervený KAD konfigurácia so zníženou dýzou LDH laktátdehydrogenáza N-mikrokryštalická celulóza MCC Národný ústav štandardov PS80 Polysorbát 80 rhgh Rekombinantný ľudský rastový hormón rhil-11 Rekombinantný ľudský interleukín-11 RP-HPLC Reverzná fáza HPLC RS Príbuzné druhy SD Tlak postrekom SDS Dodecylsulfát sodný SE-HPLC Vylučovacia chromatografia SK Štandardná konfigurácia WS Fluidné lôžko XPS RTG fotoelektrónová spektroskopia
21 1 ÚVOD Dosiahnutých 10 40 nm (Thiering et al.; 2000a). Ďalším vývojom zrážania je postrekovanie proteínového roztoku do nádoby so superkritickou tekutinou, pretože v dôsledku povrchu vytvoreného počas atomizácie vzniknú proteínové častice v priebehu niekoľkých sekúnd. Pomocou tejto technológie je možné vyrobiť častice rovnomerného tvaru a úzkej distribúcie veľkostí (Palakodaty a kol.; 1999; Yeo a kol.; 1993). V technológii superkritickej tekutiny závisia vlastnosti proteínových častíc, ako je distribúcia veľkosti častíc a morfológia, od teploty a tlaku superkritickej tekutiny (Jung et al.; 2001). Nevýhody sú zložitý proces a vysoké náklady na zákrok.
33 2 CIEĽ 22 3) Následne sa bude skúmať vplyv rôznych nosných materiálov a rôznych prísad do rozprašovacích roztokov, ako je cukor, povrchovo aktívne látky alebo antioxidanty, na fyzikálnu a chemickú stabilitu rhil-11 počas procesu aj počas skladovania. V prípade nerozpustných guľôčok MCC sa bude skúmať vplyv prísad rozprašovacieho roztoku nezávisle od účinkov rozpustnosti nosičového materiálu. 4) Lepšie pochopenie povrchového pokrytia nosiča proteínom alebo proteínovou matricou by mohlo poskytnúť dôležité vysvetlenie pre nestability proteínov, pretože proteíny môžu byť na povrchoch denaturované. Pomocou XPS sa má skúmať distribúcia rhil-11 na povrchových/blízkych povrchových vrstvách proteínových formulácií častíc.
34 3 MATERIÁL A METÓDY 23 3 MATERIÁL A METÓDY 3.1 MATERIÁLY REKOMBINANTNÉHO HUMÁNU INTERLEUKÍN-11 Pre všetky experimenty sa použil zmrazený vodný objemový roztok s približne 15 mg/ml rhil-11, 6 mM monofosforečnan sodný, 4 mM difosforečnan sodný a 300 mM glycín, pH 7,0 ( Wyeth BioPharma, Andover, USA). Pre niektoré experimenty sa glycín objemovej formulácie odstránil dialýzou proti fosfátovému tlmivému roztoku (10 mM, ph = 7). Použila sa dialyzačná skúmavka typu Spectra/Por 7 s MWCO 3000 od spoločnosti Spectrum Medical Industries Inc., USA. POMOCNÉ LÁTKY PRE EXPERIMENTY S FLUIDOVÝM POSTEBOM Záložka: Pomocné materiály pre testy s fluidným lôžkom Látka Popis Zdroj dodávky MCC-Gule (Cellets 100) 98,2% = µm Pharmatrans Sanaq AG MCC-Spheres (Cellets 200) 98% = µm Pharmatrans Sanaq AG sacharóza RFF cukor Südzucker dihydrát trehalózy Georg Breuer GmbH D-Mannitol (Pearlitol 200SD) 98,% EP Roquette D-Mannitol (Pearlitol 300DC) 98,% EP Roquette Glycine 99,0-101% Rexim (Degussa) Heptahydrát hydrogenfosforečnanu sodného Merck, Darmstadt Monohydrát dihydrogénfosforečnanu sodného Merck, Darmstadt Methionine Fluka, Buchs, Švajčiarsko
35 3 MATERIÁL A METÓDY OSTATNÉ LÁTKY Záložka: Ďalšie látky Látka Popis Zdroj dodávky Kvalita acetonitrilu HPLC, Fisher Scientific,> 99,9% Leicestershire, Spojené kráľovstvo Dusičnan amónny> 99% Grüssing, Filsum Koloidná modrá farbiaca súprava Farbivo A a B Invitrogen, Karlsruhe Chlorid lítny Riedel de Häen, Seelze Mark12 TM Molecular Standard for Invitrogen, Karlsruhe Gel elektroforéza metanol HPLC kvalita,> 99,8% Merck, Darmstadt Methionine Fluka, Buchs, Švajčiarsko Kyselina morfolinoetánsulfónová (MES)> 99,5% Sigma, chlorid sodný Steinheim ACS,> 99% Sigma, Steinheim Kvalita elektroforézy dodecylsulfátu sodného,> 99% Roth, Karlsruhe Pelety hydroxidu sodného pa> 99% Merck, Darmstadt Obsahuje MOPS, NuPAGE MOPS bežiaci Tris Base, SLS, pufor EDTA Invitrogen, Karlsruhe Obsahuje Glycerol, Tris Base, tris NuPAGE LDS Vzorka HCl,; EDTA, Invitrogen, Karlsruhe Buffer Serva Blau 250, Phenol Rot, Wasser NuPAGE redukčné činidlo O, 5M DTT Invitrogen, Karlsruhe PS80 Crillet HP, vysoko čistý Croda, Netteta kyselina trifluóroctová Sigma, Steinheim
36 3 ZARIADENIA NA SPRACOVANIE MATERIÁLU A METÓDY ZÁVOD GPCG-1 Aby bolo možné proces lepšie vizuálne sledovať, boli testy štandardne vykonané v usporiadaní horného striekania, bola použitá dvojzložková tryska s vnútorným priemerom 1 mm. Látkové filtračné vrecká sa trepali pomocou dvojkomorovej metódy. Štandardné parametre sú uvedené v tab. Záložka: Štandardné parametre GPCG-1 Pokusy: Parametre procesu, rozprašovací roztok, nosný materiál Parametre riadenia procesu Hodnota (jednotka) Rýchlosť fluidného vzduchu 1,5 m/s Rozprašovací tlakový nástavec 1,9 bar Rýchlosť podávania rozprašovanej kvapaliny 2,8 g/min Vstupná teplota 30 C Interval pretrepávania (filter) každých 10 sekúnd (asynchrónny) ) Formulácia postrekovej kvapaliny rhil-11 2,5 mg/ml fosfátového tlmivého roztoku 10 mM, ph = 7,0 glycínu 300 mM množstvo postrekovej kvapaliny 250 g množstvo nosičového materiálu 300 g
37 3 MATERIÁL A METÓDY MINI-GLATT SYSTÉM Na začiatku vývoja sa procesy uskutočňovali v konfigurácii spodného striekania bez použitia párkov. Na postrek sa použila dvojkapalinová dýza s vnútorným priemerom 0,5 mm. Fluidizácia nosného materiálu a atomizácia rozprašovacieho roztoku prebiehala stlačeným vzduchom z domáceho vedenia (6 bar). Stlačený vzduch bol nastavený v systéme pomocou redukčného ventilu. Teplotu fluidizačného vzduchu je možné upraviť zahrievaním v systéme. Štandardné parametre sú uvedené v tab. Záložka: Štandardné hodnoty Mini-Glattove experimenty: Parametre procesu, postrekový roztok, nosný materiál Parametre riadenia procesu Hodnota (jednotka) Fluidizačný tlak 0,5 bar Tlak postreku 0,5 bar Rýchlosť nástreku kvapaliny 0,36 g/min Teplota produktu 32 C Interval ofukovania (filter) 10 s Fúkaný tlak (filter) 1 bar Formulácia sprejovej kvapaliny rhil -11 4 mg/ml fosfátového tlmivého roztoku 10 mM, ph = 7,0 glycínu 300 mM množstvo postrekovej kvapaliny 15 g množstvo nosičového materiálu 20 g