Vyšetrovanie expozície akrylamidu a akroleínu pomocou biomonitorovania potravín a ľudí
1 Štúdie vystavenia akrylamidu a akroleínu prostredníctvom biomonitoringu potravín a ľudí Dizertačná práca D386 schválená katedrou chémie Technickej univerzity v Kaiserslauterne na udelenie akademického titulu doktor prírodných vied, ktorú udeľuje absolvent potravinárskeho chemik Meike Rünz Vedenie práce: Prof. Dr. Elke Richling Dátum vedeckej diskusie:
3 Experimentálna časť tejto práce sa uskutočňovala od apríla 2013 do februára 2017 na katedre chémie so špecializáciou na potravinársku chémiu a toxikológiu na Technickej univerzite v Kaiserslauterne v skupine Prof. Dr. Vystúpila Elke Richling. Predseda skúšobnej komisie: Prof. Dr. Helmut Sitzmann, prvý spravodajca: prof. Dr. Elke Richling 2. Reportér: Prof. Dr. DR. Dieter Schrenk
5 Obsah I Obsah Obsah. I Zoznam skratiek. V abstraktné. X krátke zhrnutie. XI 1 Úvod Stav vedomostí Všeobecné princípy Hodnotenie rizika Environmentálne a ľudské biomonitorovanie Tepelne indukované kontaminanty potravín Akrylamid Fyzikálno-chemické vlastnosti Vzdelávanie Priemyselná syntéza Exogénna tvorba Endogénna tvorba Hladiny v potravinách Faktory ovplyvňujúce hladiny v potravinách Toxikokinetika Absorpcia a distribúcia Metabolizmus Vylučovanie Toxikodynamika Akútna toxicita Neurotoxicita Reprodukčná toxicita Vývojová toxicita Genotoxicita a mutagenita Odhad expozície Odhad expozície pomocou monitorovania životného prostredia Odhad expozície pomocou biomonitorovania človeka Charakterizácia rizika a riadenie rizík Akroleín Fyzikálno-chemické vlastnosti Vzdelávanie Priemyselná syntéza Exogénne vzdelávanie Endogénne vzdelávanie Obsah potravín Faktory ovplyvňujúce obsah potravy. 52
6 II Obsah Toxikokinetika Absorpcia a distribúcia Metabolizmus Vylučovanie Toxikodynamika Akútna toxicita Subchronická toxicita Chronická toxicita Genotoxicita a mutagenita Karcinogenita Hodnotenie expozície Hodnotenie expozície pomocou monitorovania životného prostredia Hodnotenie expozície pomocou biomonitorovania človeka Charakterizácia rizika Problémy Výsledky a diskusia Vývoj a validácia HPLC-ESI-akrylamid-MS/MS-potraviny a merkapturové kyseliny spojené s akroleínom v moči Štúdia na ľuďoch I Analýza vývoja hmotnosti Analýza denných aktivít Analýza potravín Akrylamid Akroleínový proteín Asparagín Výpočet denného príjmu potravy Akrylamidový príjem Príjem vysoko ohriatych potravín Príjem bielkovín Príjem asparagínu Príjem sacharidov Príjem tuku Analýza energie analýza akroleínu v miestnosti v moči testovaných osôb objemy moču merkaptéry spojené s kreatinínom a akrylamidom kyslé merkapturové kyseliny spojené s akroleínom
7 Obsah III 4.3 Štúdie o uvoľňovaní akroleínu, štúdia na ľuďoch II Výpočet denného príjmu vysoko tepelne upravených potravín Stanovenie zdrojov vystavenia účinkom exogénneho akroleínu v potrave Analýza moču Testované objemy Objem moču Kreatinín Kyseliny merkapturové spojené s akroleínom Zhrnutie Materiály Pomôcky Spotrebný materiál Chemikálie Metódy Stanovenie akrylamidu v potravinách Príprava vzorky Meranie vzorky Vývoj metódy Metóda Validácia parametrov HPLC a ESI pos-ms/ms parametre Kalibračné čiary Stanovenie akrylamidu a merkapturových kyselín spojených s akroleínom v moči Príprava vzorky Príprava vzorky Meranie metódy Vývoj metódy Validácia metódy Parametre HPLC a ESI neg-ms/ms Kalibračné čiary Odhad hladín živín a energie v potravinách s použitím Prodi 5.8 Expert Stanovenie kreatinínu v moči Príprava experimentu Vykonanie experimentu Syntéza N-acetyl-S- (3-oxopropyl) cysteínu n-asociované kyseliny merkapturové v tlmivom roztoku fosforečnanu draselného Príprava vzorky Meranie vzorky Výpočty a štatistika Výpočet AUC Anderson-Darlingov test Spárovaný a nepárový t-test Wilcoxonov test
8 IV Obsah Mann-Whitneyho U-test Informácie o štúdiách na ľuďoch Štúdie na ľuďoch I Zákonné schválenie Nábor subjektov Predbežné lekárske vyšetrenie Skríning potravín (obsah akrylamidu) Dodatočné informácie Štúdium na ľuďoch II Zákonné oprávnenie Nábor subjektov Predbežné lekárske vyšetrenie Bibliografia Príloha CV. i zoznam publikácií. iii Poďakovanie. v vysvetlenie. vii
9 Zoznam skratiek V Zoznam skratiek 8-OHdG AA AA-Hb AAMA AAMA-SO AC Ade AGE AKR ALARA ALDH AO AUC BfR BHA BHT BMDL BMI BSO BVL CA CAD CE CEMA CEP CHO cll c max CO 2 c dávka CRP CUR c vymývanie 8-hydroxydeoxyguanu Akrylamid Adukt akrylamid-hemoglobín N-acetyl-S- (2-karbamoyletyl) -L-cysteín N-acetyl-S- (2-karbamoyletyl) -L-cysteín-S-oxid akroleín adenín pokročilé glykácie konečné produkty aldo-keto-reduktáza Tak nízko, ako primerane dosiahnuteľný Tak nízko, ako rozumne dosiahnuteľný Aldehyddehydrogenáza Aminooxidáza Plocha pod krivkou Plocha pod krivkou Federálny inštitút pre hodnotenie rizík Butylhydroxyanizol Butylhydroxytoluén Dolná hranica spoľahlivosti referenčnej dávky referenčná dávka dolná hranica spoľahlivosti Dolný limit spoľahlivosti Body-Mass-Index Buthioninsulfoximinionally energia zrážky plynu zrážky energia energia zrážky N-acetyl-S- (2-karboxyetyl) -L-cysteínový článok intrittspotenciálny vstupný potenciál do bunky Ovarie čínskeho trpasličieho škrečka čínsky škrečok vaječník chronická lymfocytová leukémia maximálna koncentrácia oxid uhličitý počiatočná koncentrácia C-reaktívny proteínový záves plynná opona koncentrácia plynu po fáze vymývania
17 Úvod 2 nedostatočné údaje o percente vylučovania expozičných biomarkerov. V závislosti od predpokladaného percenta vylučovania akroleínu ako HPMA počas 24 hodín sa určila priemerná denná expozícia akroleínu 2,1 - 24 µg/kg telesnej hmotnosti (SKLM, 2012). Expozícia odhadnutá pomocou ľudského biomonitorovania neodráža iba príjem akroleínu z potravy, ale aj expozíciu z endogénnej tvorby a z iných exogénnych zdrojov akroleínu. Je potrebné objasniť, do akej miery potraviny prispievajú k vylučovaniu biomarkerov expozície akroleínu v porovnaní s inými exogénnymi zdrojmi akroleínu a/alebo k endogénnej formácii.
32 17 Stav vedomia Obrázok 13: Metabolizmus akrylamidu, AA: akrylamid, AAMA: N-acetyl-S- (2-karbamoyletyl) -L-cysteín, AAMA-SO: N-acetyl-S- (2-karbamoyletyl) -L- cysteín-S-oxid, Ade: adenín, DHPA: 2,3-dihydroxypropanamid, DHPS: kyselina 2,3-dihydroxypropánová, DNA: kyselina deoxyribonukleová, EH: epoxidhydroláza, GA: glycidamid, GAMA: N-acetyl-S- (2-karbamoyl) -2-hydroxyetyl) -L-cysteín, GSH: glutatión, GST: glutatión-S-transferáza, Gua: guanín, Hb: hemoglobín, izogama: N-acetyl-S- (1-karbamoyl-2-hydroxyetyl) - L-cysteín [upravené z (EFSA, 2015a), doplnené (Sumner et al., 2003; Doerge et al., 2005a; Tareke et al., 2006)]
35 Stav vedomostí 20 Reprezentujúce uvoľňovanie CO 2. Presné štúdie, ktoré by dokázali túto degradačnú cestu, zatiaľ neexistujú. Konjugácia akrylamidu a glycidamidu s glutatiónom a štiepenie na kyseliny merkapturové. Okrem hydrolýzy epoxidov prebieha detoxikácia akrylamidu a glycidamidu aj reakciou s glutatiónom a následným metabolizmom na zodpovedajúce kyseliny merkapturové (pozri obrázok 14). Obrázok 14: Tvorba AAMA a AAMA-SO z akrylamidu a GAMA a izo-gamy z glycidamidu, AA: akrylamid, AAMA: N-acetyl-S- (2-karbamoyletyl) -L-cysteín, AAMA-SO: N- Acetyl-S- (2-karbametyletyl) cysteín-S-oxid, DiP: dipeptidáza, GA: glycidamid, GAMA: N-acetyl-S- (2-karbamoyl-2-hydroxyetyl) -L-cysteín, GGT: -glutamyl transpeptidáza, Glu: kyselina glutámová, Gly: glycín, GSH: glutatión, GST: glutatión-S-transferáza, izogama: N-acetyl-S- (1-karbamoyl-2-hydroxyetyl) -l-cysteín, NAT: N-acetyltransferáza [upravené od (Duda-Chodak et al., 2016)]
62 47 Stav vedomia Obrázok 19: Predpokladané cesty tvorby akroleínu z glukózy [upravené z (Stevens a Maier, 2008)] Tvorba z aminokyselín a ďalších aminokyselín Tvorba z metionínu Tepelne indukovaná tvorba akroleínu je tiež opísaná v súvislosti so Streckerovou degradáciou aminokyseliny metionínu ( pozri obrázok 20). V priebehu Maillardovej reakcie sa metionín a dikarbonylová zlúčenina môžu previesť na Schiffovu bázu, ktorá sa hydrolýzou stane Streckerovým aldehydom metionálom. Methional môže ďalej reagovať na metántiol a akroleín prostredníctvom retro-Michaelovho štiepenia (Stevens a Maier, 2008). Obrázok 20: Predpokladaná cesta tvorby akroleínu z metionínu, R1 a R2: alkylová alebo alkenylová skupina [upravené od (Stevens a Maier, 2008)]
70 55 Stav znalostí Obrázok 24: Metabolizmus akroleínu. AC: akroleín, AC-GSH: AKR: aldo-keto-reduktáza, ALDH: aldehyddehydrogenáza, CEMA: N-acetyl-S- (2-karboxyetyl) -L-cysteín, DNA: kyselina deoxyribonukleová, EH: epoxidhydroláza, FMO: flavín- závislá monooxygenáza, glycidaldehyd-MA: N-acetyl-S- (2-karboxy-2-hydroxyetyl) -L-cysteín, GSH: glutatión, GST: glutatión-S-transferáza, HPMA: N-acetyl-S- (3- hydroxypropyl) -L-cysteín, OPMA: N-acetyl-S- (3-oxopropyl) -L-cysteín, OPMA-SO: N-acetyl-S- (3-oxopropyl) -L-cysteín-S-oxid, α -oh-pdg: a-hydroxy-ln2-propano-2-deoxyguanozín, -OH-PdG, -hydroxy-lN2-propano-2`-deoxyguanozín, Δ: detegované in vivo [upravené z (Parent et al., 1998; Stevens a Maier, 2008)]
72 57 Kapitola o stave poznania). Mechanizmus tvorby kyseliny glycidaldehyd-merkapturovej z glycidaldehydu je znázornený na obrázku 25, analogicky k mechanizmu založenému na akroleíne. Obrázok 25: Tvorba HPMA a CEMA z akroleínu a glycidaldehydu-MA z glycidaldehydu, AC: akroleín, AKR: aldo-keto-reduktáza, ALDH: aldehyd-dehydrogenáza, CEMA: N-acetyl-S- (2-karboxyetyl) -L- cysteín, DiP: dipeptidáza, FMO: flavín-dependentná monooxygenáza, glycidaldehyd-MA: N-acetyl-S- (2-karboxy-2-hydroxyetyl) -L-cysteín, GGT: -glutamyl transpeptidáza, Glu: kyselina glutámová, Gly: glycín, GSH: glutatión, GST: glutatión-S-transferáza, HPMA: N-acetyl-S- (3-hydroxypropyl) -L-cysteín, NAT: N-acetyltransferáza, OPMA: N-acetyl-S- (3-oxopropyl) - L-cysteín, OPMA-SO: N-acetyl-S- (3-oxopropyl) -L-cysteín-S-oxid [modifikovaný (Horvath a kol., 1992; Stevens a Maier, 2008)]